α-n-乙酰半乳糖胺酶突变文库建立及筛选

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1、201l届华东师范人学硕+学位论文论文摘要Q-N．乙酰半乳糖胺酶是血型转换的工具酶，可以降解A型红细胞表面抗原、消除其抗原抗体反应，在输血治疗中，可以避免血型配型带来的不便。本实验室从报道的Q-N．乙酰半乳糖胺酶中选取活性最好的酶，构建Q．N．乙酰半乳糖胺酶的原核表达载体，表达并纯化Q-N．乙酰半乳糖胺酶，检测酶活性。利用定点突变技术，在关键位点进行突变，用高通量筛选技术筛选突变文库，期望得到较高活性的Q-N．乙酰半乳糖胺酶。本课题的研究工作主要包括以下两部分：1．CI．N．乙酰半乳糖胺酶的构建为了建立新型Q-N．乙酰半乳糖胺酶的筛选

2、、检测方法，我们提取脑膜金黄杆菌的基因组DNA，以此为模板PCR扩增出n-N．乙酰半乳糖胺酶(A4)。将A4克隆至pET-24a载体，转化B121表达菌株进行蛋白表达。使用亲和层析方法纯化His-A4酶，选择显色底物验证酶活性。同时，我们改进了传统的ELISA方法，直接将红细胞膜包被于ELISA检测平板中，以红细胞膜表面抗原作为直接底物，用ELISA方法检测酶活性。此研究建立了新型ELISA实验方法，以此方法验证了A4酶的活性，证明了此酶能够有效降低红细胞表面抗原抗体反应，且具有浓度和时间依赖性。2．a．N．乙酰半乳糖胺酶突变文库的筛

3、选自然界中的Ⅱ-N．乙酰半乳糖胺酶活性较低，不足以大规模生产酶用于通用型血的制各。在本实验中，使用定点突变技术结合高通量筛选方法，期望得到活性较高的糖苷酶。我们突变了酶的6个氨基酸位点分别是96、98、179、181、225、228，筛选了2400个左右的重组子，从实验中可知，179、181、225、228位置突变后酶的活性大幅度下降，因此这四个位点对酶的活性至关重要。96、98这两个位点突变后，有4个突变酶活性相当，它们突变后活性改变的机理需要进一步研究。关键词：Q-N．乙酰半乳糖胺酶；定点突变；高通量筛选2011届华东师范大学硕J

4、：学位论文ABSTRACTAlpha-a-N-acetylgalactosaminidasebelongstoallimportantfamilyofenzymesthatcallbeusedtodegradesurfaceantigenonthesurfaceofA-typeredbloodcellstoeliminatetheantigen—antibodyreaction．Itcanhelptorelievesdifficultiesassociatewithtypingandcrossmatchinginbloodtransf

5、usion．Thebestactivityofa-N-acetylgalactosaminidasewasselectedandtherecombinantplasmidWasconstructed．WiththeexpressionandpurificationofⅡ-^-acetylgalactosaminidase，itsenzymekineticsweremeaSured．ThekeysiteoftheenzymeWasmutatedbyPCRdirectedmutagenesis．Wehopedtogetthehighere

6、fficiencyofa-N-acetylgalactosaminidasethroughhigh—throughputscreening．ThemainobjectivesareasfoIlows：1．Theconstructionofa-N-acetylgalactosaminidaseThecodingregionofalla-N—aeetylgalactosaminidase(A4)WasPCRamplifiedfromgenomieDNAofChryseobacteriummeningosepticumandsubclone

7、dintopElr24a．A4foroverexpressionHis．A4．TheoverexpressedHis-A4enzymewaspurifiedusingaff'mitychromatographyandhasactivitythatiscomparablewithliteraturereportedusingaconventionalmethodwithanartificialsubstrate．Tobettermeasuretheactivityofa-N．acetylgalactosaminidaseinrealap

8、plication,weestablishedanovelmethodthatdirectlyusethesurfaceantigenofredbloodcellassubstrateanduseELISAtodetec