微生物合成γ-聚谷氨酸及其分子生物学的研究

《微生物合成γ-聚谷氨酸及其分子生物学的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要摘要生物可降解材料、药物靶向和缓释材料等可供选择的种类，难以满足日益发展的环境保护和药物治疗的需要。丫．聚谷氨酸(丫．PGA)因其良好的水溶性、生物降解性、生物相容性和安全无毒性，以及分子链上具有的高活性侧链羧基，易于发生交联、螯合和衍生化，在医药、食品、化妆品和农业领域具有广阔的发展前景和巨大的开发潜力。目前，亟需解决的是如何提高单位产量以降低成本，并实现对单体组成和分子量的可控性，这就要求从丫．PGA的生物合成途径进行深入研究。本研究从发酵食品中分离到4株谷氨酸依赖型和1株非谷氨酸依赖型丫．PGA合成

2、菌，通过16SrRNA和BIOLOG初步鉴定为：BacilluslicheniformisCDL-1，B．subtilisCDL-2，B．subtilisCDL广16，B．subtilisCDLl7和B．subtilisCD【广19。利用紫外光谱扫描、TLC、1H-NIVIR、RT-HPLC和GPC等技术对发酵产物进行鉴定和分析，结果表明5株菌合成的丫-PGA产物中D．谷氨酸含量在5．80％--33．95％之间，重均分子量‰为347kD--443kD，分散度为1．19~1．44。低D．谷氨酸单体含量、低分子量和分

3、子量分布小的-／-PGA在医药、化妆品和食品领域具有很大应用价值。本研究利用分子微生物学手段，对本室的谷氨酸依赖型B．1icheniforral$N'K-03和谷氨酸非依赖型7-PGA合成菌Bacillussp．LL3产1'-PGA进行了深入研究。首先，采用特异性细菌促旋酶基因gyrA，将Bacillussp．L”进一步鉴定为B．amylo砌uefaciensLL3，并首次克隆获得其丫-PGA合成酶基因pgsBCA。通过与B．amylo砌uefaciensFZB42、B．subtilis168、B．1icheni

4、formisATCCl4580、B．pumilusSAFR-032-等标准菌株的PgsBCA氨基酸序列比对发现，PgsB和PgsC具有94．35和94．09％高度同源性，而PgsA差异性较大，只有79．85％一致性。设计含有pgsBCA基因的表达载体pTrepgs，及pgsBCA、谷氨酸消旋酶基因racE的双基因重组载体pTreRP，分别在EcoliJMl09进行表达。在以葡萄糖或【广谷氨酸作为底物的LB(含M孑+和IVln2+)培养基进行发酵，结果显示L．谷氨酸相对于葡萄糖为更好的底物，含LL3pgsBCA的重

5、组菌其丫．PGA产量高于NK-03，推测来源于LL3的PgsBCA比NK-03催化能力要强，较强的催化能力要求更多的L-谷氨酸底物供应；当培养基中提供足够的L谷氨酸时，聚合酶催化合成的中文摘要y-PGA差距明显缩小，这表明足量的底物供应可能比合成酶催化能力对高产y-PGA更为重要，PgsBCA可能不是lr-PGA合成菌分型的决定因素。另外，通过穿梭载体pXMJl9将№003菌株的pgsBCA基因以原生质体方法转化谷氨酸棒杆菌CglutamlcumATCCl3032，在Cglutamtcum生产L谷氨酸的培养基中加

6、入IPTG诱导后，可以合成产量为O．69g／t,、重均分子量(坻)为73071、D．谷氨酸单体占3％的),-PGA，实现了),-PGA以糖类为底物的“一步法”合成。以正交设计方法对B．amyloliquefaciensLL3发酵生产y-PGA的培养基配方进行优化。分析结果表明，蔗糖对试验组影响最大、为最显著因子，最优组合为蔗糖50g／L、fNH4)2S042g／L和MgS040．6g／L，此时y-PGA产量提高了3．2倍。在此配方基础上进行了30L和200L的体系放大，发酵过程中菌体生长、相对粘度、y-PGA产量

7、和蔗糖利用等过程参数呈现稳态变化，其中200L体系培养44h时3,-PGA最高产量为4．36g／L，接近2g／L(NI-L)2S04全氨基转移作用可能生成的量(4．46g／L)，而(NH4)2S04可能成为限制放大发酵产量的关键因素。另外，采用苯酚硫酸法测定了U3发酵生产丫．PGA时含有的多糖副产物成分占到了36％，于是尝试构建打靶载体，借助同源重组将多糖基因从LL3染色体中进行敲除。本研究已经扩增到胞外多糖合成关联基因epsA上下游同源区片段，并以pET30aKan。作为筛选标记，3个片段混合连接于pBlues

8、enptSK(．)质粒上，构建打靶载体pBSukd。目前在探索野生菌LL3的转化方法，期望借助epsA基因敲除后可能引起的代谢流改变，提高LL3合成y-PGA的能力。关键词：Y．聚谷氨酸；y-PGA合成酶；pgsBCA；穿梭载体pXMJl9；胞外多糖nAbstractItiswell-knownthattheappropriablematerials丽mbiodegrad