环境生物学实验指导

《环境生物学实验指导》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、环境生物学实验报告9岳北农林韦枚大学NorthwestA&FUniversity学院：资源环境学院班级：环科121姓名：李恩德学号：2012011757环境生物学综合实验—重金属污染对土壤微生物群落结构的影响一、实验目的(1)通过实骑骑证重金属污染对土壤生物学性质的影响。(2)了解Cu、Ni和Cr元素对土壤微生物的潜在毒性。(3)掌握土壤中细菌群落结构的分子测试方法(4)掌握重金属对土壤微生物性质影响和评价的研究方法。二、实验原理微生物群落结构是表征土壤生物学性状的重要指标。土壤受到重金属污染后，重金属的毒性亦能够对土壤微牛物产牛影响

2、，可表现为微牛物的多样性改变、微生物数量降低以及酶活性变化。细菌作为上壤微生物的主要组成部分，其群落结构的变化可敏感地反映岀土壤受到重金属污染的剧烈程度。细菌的群落结构可以用其优势种群的数量来表16SrDNA序列分析是区分不同细菌种群的有效方法之一，它可鉴别生物物种的遗传多样性。本实验依据不同细菌之间具有的遗传多样性差异特征，利用细菌的16SrDNA通用引物，通过PCR技术，收集扩增产物，再利用限制性内切酶对其进行酶切分型，统计不同酶切类型及其所占的比例，进而获得细菌多样性的信息。利用不同重金属污染环境下细菌多样性变化的特征，评估不同

3、污染物对土壤细菌群落结构的影响程度。三'实验仪器(一)实验的主要仪器培养箱，恒温摇床，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，超净工作台，高速冷冻离心机,离心机，水浴锅，灭菌锅，移液器(10pL、5OyL、200pL、ImL、5mL)等。(-)器Jill1000mL烧杯用于土壤培养；150mL锥形瓶用于土壤悬液的振荡，100mL离心管用于菌液分离，直径为80mm的培养皿用于微生物平板鉴定。另外，配备1000pL、200pL、20gL吸头盒及吸头，1.5mL离心管各一盒，预先进行灭菌处理，置于超净台中保存。四、实验试剂(-)主要生化试剂1.2mm

4、ol/L焦磷酸钠溶液称取0.446g焦磷酸钠溶于水中，移入500mL容量瓶，用水定容至刻度。2.LB液体培养基称取10.0g蛋口月东，5.0g酵母浸粉，5.0gNaCl于烧杯屮，用量筒量取1L蒸憎水,将其加入烧杯中，置于垫有石棉网的电炉上微微加热，用玻璃棒不断搅拌，待试剂全部溶解后,用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值为7.0o将其转入1L“蓝盖玻璃瓶”屮，置于灭菌锅中高温灭菌(12rC,35min),冷却后分别倒入10个己灭菌过的150mL锥形瓶中，用灭菌的棉球封口，置于超净台中保存，供接种时使用。3.LB平板培养基称取10.

5、0g蛋口腺，5.0g酵母浸粉，5.0gNaCl及12g琼脂粉于烧杯中，加入1L蒸係水，电炉上加热，用玻璃棒不断搅拌，待试剂全部溶解后，用lmol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值为7.0o将其转入1L“蓝盖玻璃瓶”中，置于灭菌锅中高温灭菌(12rC,35min),冷却到85°C左右时，小心取出，在超净工作台中分别倒入培养皿中，每只皿的体积大约17-20mL,静置至平板固化。置于超净台中保存，供接种时使用。4.异丙醇5.75%乙醇：量取75mL无水乙醇，用蒸镯水定容至100mL。6.5xKCM：称取3.72g氯化钾，2.21g二水合氯化钙

6、，5.08g六水合氯化镁溶于水中，移入100mL容量瓶，用水定容至刻度。7.电泳缓冲液50xTAEBuffer配制：称量Tris242g,Na2EDTA.2H2O及18.6g于IL烧杯中，向烧杯屮加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀。加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解。用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1L后，室温保存。使用吋稀释50倍或100倍(lxTAE或0.5XTAE)。8.EB染色剂漠乙噪染色液(EB)10mg/mLo在1L去离子水中加入人约500此的EB液体试剂,溶液稍微变红即可，置于搪瓷盒屮，用于琼脂糖电泳胶的染

7、色。注意EB属于强致癌物,必须小心操作。9•点样缓冲液Loadingbuffer(10x)：0.25%澳酚蓝，40%甘油。10.琼脂糖(一)其他试剂重金属污染物：硫酸铜，硫酸银，銘酸钾。五、实验方法(一)实骑处理设置和土壤培养1.土样准备采集0-20cm农田表层土壤样品，自然风干，磨细，过孔径1mm土壤筛。2.添加重金屈处理采用人为添加重金属污染物的方法模拟重金属污染的土壤。重金展污染的强度采用《土壤环境质量标准》屮三级指标的限值。以不加重金属的土壤为对照（加水培养）。表1国家土壤坏境质量标准（浓度单位：mg/kg）项目土壤类型级另一

8、级指标二级指标三级指标自然背景值pH<6.5pH6.5-7.5pH>7.5Cd<0.20.30.30.61Hg<0.150.30.511.5As水出三1530252030旱地冬1540302540Cu农田w3550100