bruton酪氨酸激酶泛素化调节的研究

《bruton酪氨酸激酶泛素化调节的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、Bruton酪氨酸激酶泛素化调节的研究房宜嘉胡媛媛凌兰兰陈月史玉叶张莉王春玲于亮南京医科大学附属淮安第一医院血液科摘要：目的:探讨Bruton酪氨酸激酶(Bruton'sTyrosineKinase,Btk)的代谢调节途径和可能的分子机制。方法:用蛋口酶体抑制剂和/或佛波酯(PMA)处理内源性表达Btk的B细胞系A20、Ramos细胞及转染了外源性Btk的293T、COS-7细胞，应用RT-PCR法检测上述细胞BtkmRNA表达水平‘Westernblot法检测Btk蛋白表达水平;通过抗TgM抗体交联BCR刺激A20细胞，检测细胞Btk泛素化水平;用Bt

2、k、泛素和Cbl共转染COS-7细胞，检测其泛素化Btk水平;用Btk和编码野生型或突变型泛素(K29R、K48R、K63R)即单泛素的质粒共转染293T细胞,经蛋白酶体抑制剂处理后用抗泛素抗体和抗Btk抗体检测泛素化Btk水平;稳定转染并表达Btk-GFP的293T细胞经氯唾处理后，应用Westernblot检测其Btk蛋白表达水平。结果:蛋白酶体特异性抑制剂和/或佛波酯可减少Btk转录，从而引起Btk蛋白表达下降。Btk通过泛素化进行翻译后修饰，泛素化修饰程度与Btk的表达及活化水平有关。Cbl为Btk的E3泛素连接酶，它可导致Btk泛素化。Btk受

3、多聚和/或单泛素化调节，Btk可在溶酶体内发生泛素化和降解，溶酶体抑制剂氯唾可上调Btk的表达。结论:Btk蛋白的表达水平受泛素化途径调节，该调节与Btk的表达水平有关。关键词：Bruton酪氨酸激酶;泛素化;蛋白酶体抑制剂;B细胞;作者简介：于亮，主任医师，副教授，博士生导师.E-mail:yuliangha@163.com收稿日期:2016-07-03基金：国家自然科学基金资助项目(81170489)DifferentialRegulationofBruton'sTyrosineKinasebytheUbiquitinPathwayFANGYi-Ji

4、aHUYuan—YuanLINGLan—LanCHENYueSHIYu-YeZHANGLiWANGChun-LingYULiangDepartmentofHematology,Huai'anFirstPeople'sHospital,NanjingMedicalUniversity;Abstract：Objectivc:ToinvestigatctheregulationofBruton，styrosinekinase(Btk)andtoexploreitspossiblemechanism.Methods:Aftertreatmentwiththepr

5、oteasomeinhibitorsand/orphorbolesters(PMA),themRNAandproteinexpressionlevelofBtkwasdetectedbyRT-PCRandWesternblot,respectively.TheubiquitinationlevelofBtkinBlymphoblastoidA20cellswasestimatedafterstimulationviathecrosslinkingofBCRwithanti-lgMantibody.ThecotransfectionofCOS-7cellw

6、ithBtk,ubiquitinandCblwasperformed,thentheubiquitinationlevelofBtkwasmeasured.TheBtkubiquitinationlevelwasdetectedafterectopicexpressionofubiquitintransfectedwiththewildtypeortriplemutantofUb(K29R,K48R,K63R).Mono-ubiquitinationofBtkwasdetectedwithantibodiespreferentiallyagainstmo

7、novalentubiquitin;inaddition,theproteinexpressionlevelsofchloroquine-treatedstablytransfectedcellsexpressingBtk-GFPweredetectedbyWesternblot,andquantifiedwiththestrengthofGFPfluorescence.Results:Tnthepresenceofprotcasomc-spccificinhibitorsemd/orPMA,steady-statelevelsofBtkproteinw

8、erereducedduetodecreaseoftranscription.P