基于等温放大反应检测microrna

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1、ClassifiedIndex:CODE:10075U.D.C.:NO:20101095ADissertationfortheDegreeofM.SSensitivedetectionofmicroRNAswithisothermalamplificationreactionCandidate:LiuXiaolingSupervisor:ProfessorLiZhengpingAcademicDegreeAppliedfor:Master’sDegreeSpecialty:AnalyticalChemistryUniversity:HebeiUniv

2、ersityDateofOralExamination:June,2013摘要摘要microRNA（miRNA）是一类内源性的非编码单链小分子RNA，约18~25个碱基，它通过与目标信使RNA结合来调控基因的表达，据推测，miRNA调节着人类约60%的基因表达，并且miRNA的表达水平与人类某些重大疾病如癌症密切相关。因此miRNA的定量检测和表达分析对深入研究其生物功能、临床诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重大意义。环诱导等温放大反应能够通过一步操作实现miRNA的灵敏检测，但是该方法的一个缺点是必须使用一条很长的DNA模版，而且需要利用三条

3、不同的引物(FIP，BIP和B3)发生多次反应来生成该反应的起始结构——一条两端成环状的哑铃型结构的DNA模板，该DNA模板引发了自动循环的链取代DNA的合成，最终产生DNA指数扩增。在本文中，我们直接设计了一条双环哑铃型结构的DNA模板，其3′端悬着一段与miRNA互补的序列，该方法仅用一条引物（BIP），以miRNA引发等温放大反应，只需一步反应就能产生这条双环哑铃型结构的DNA模板。利用该等温放大反应能检测低至10amol的miRNA，线性范围跨越5个数量级，能区分miRNA间的单碱基差异。该方法只使用一种酶，无需荧光标记的DNA探针，利用普通

4、的SYBRGreenІ荧光染料，一小时内即可完成miRNA的检测，因此，该方法在microRNA分析中具有很好的应用前景。关键词等温放大反应双环哑铃型结构microRNAIAbstractAbstractMicroRNAs(miRNAs),aclassofendogenous,nonprotein-codingsmallRNAs(18~25nucleotides),playimportantrolesingeneexpressionregulationbythecombinationwithtargetmRNAs.Presumably,miRNAre

5、gulatesabout60%ofgeneexpressionofhuman,andmiRNAexpressionlevelsinhumancellscanbecloselylinkedwithsomeseriousdiseasessuchasthedevelopmentofcancer.Therefore,thequantitativedetectionandexpressionanalysisofmiRNAsareofgreatsignificancein-depthstudyofitsbiologicalfunction,clinicaldia

6、gnosisandtreatmentaswellasthedrugdevelopmentrelatedtogenes.Loop-mediatedisothermalamplificationreactioncanrealizethesensitivedetectionofmiRNAswithone-stepoperation.AdisadvantageoftheLAMP-basedmiRNAdetectionistherequirementofalongDNAtemplateandforwardinnerprimer(FIP),backwardinn

7、erprimer(BIP),andouterprimers(B3)toproduceadoublestem-loopDNAwithmultiplexreactionsteps.Thedoublestem-loopDNAthenservesasthestartingmaterialtoperformauto-cyclingstranddisplacementDNAsynthesis,whichcanexponentiallyamplifytheDNA.Inthispaper,wedirectlydesignadouble-stem-loopDNAtem

8、platecontainingahangedDNAprobeatits3’-terminal,whichis