pcdna3%2fmifn-γ真核表达质粒构建及其对分泌型柯萨奇病毒b3+vp1基因疫苗免疫作用影响

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1、中文摘要pcDNA3／mlFN—Y真核表达质粒的构建及其对分泌型柯萨奇病毒B3VPl基因疫苗免疫作用的影晌摘要目的：柯萨奇B组病毒(Coxsackievims，CVB)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体。血清流行病学研究资料显示，25％～50％急性心包炎患者、36％～65％急性心肌炎患者有近期或复发CVB感染，其中以CVB3最为常见。目前尚无有效的病毒特异性防治措施来保护人类免受其危害，而基因疫苗则为预防CVB3感染提供了可能性。VPl是CVB3主要的衣壳蛋白，具有较强的免疫原性，可刺激机体产

2、生保护性的中和抗体，但已有的国内外研究表明，编码VPl的DNA疫苗免疫小鼠后虽可诱导机体产生中和抗体，但效价较低，不能有效阻止致死量CVB3感染。因此如何增强VPl基因的免疫原性，提高免疫保护作用是目前亟待解决的问题。已有研究证明，一些细胞因子作为基因佐剂，可明显提高某些DNA疫苗的免疫效应。干扰素y(interferon—Y，IFN．Y)是1973年Youngner掣11培养淋巴细胞时在培养液中发现的一种干扰索，其来源及抗原性不同于以往发现的干扰素，1980年命名为IFN-Y。1981年Georgiades等f2J将IF

3、N-Y基因克隆成功。IFN-Y的生物学活性具有严格的种属特异性，具有广泛的免疫调节作用：它通过诱导2-5A合成酶，进而活化RnaseL，降解病毒RNA，从而抑制病毒蛋白的合成；另外，IFN．Y可诱导巨噬细胞、T细胞、B细胞等细胞MHC．I和MHC．II类分子表中文摘要达，从而提高抗原提呈能力；促进活化的巨噬细胞释放过氧化氢，诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)合成，是IFN．Y杀伤胞内病原体和抗肿瘤及抑制病毒复制的主要分子机制：也可活化NK细胞，提高其杀伤能力，而活化的NK细胞又可以分泌IFN-Y；在小鼠的实验模型

4、中，IFN．Y可使IgG2a分泌增加，而降低IgG3、IgGl、IgG2b和IgE水平。鉴于IFN．Y有明显增强免疫和免疫调节作用，本研究构建了小鼠IFN．Y基因真核表达质粒，并与分泌型CVB3VPl真核表达质粒pcDNA3／sVPl共同免疫小鼠，通过血清中和抗体水平、对致死量CVB3攻击的保护作用、致死量病毒攻击后小鼠血中病毒滴度及小鼠心肌组织病理学改变来评价其免疫效力。方法：(1)从经有丝分裂原ConA诱导的小鼠脾脏巨噬细胞中提取总RNA，用自行设计的小鼠IFN．Y(mIFN—Y)特异性引物进行RT-PCR扩增；(2)

5、将扩增产物与pGEM-T载体连接，转化E．coliDH5Q大肠杆菌，筛选重组子，提取质粒进行酶切鉴定和测序：(3)取双酶切的mlFN-Y片段与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建真核表达重组质粒pcDNA3／mlFN．Y；(4)用碱裂解法从转化的DH5Q中大量提取pcDNA3／mlFN．Y、pcDNA3／sVPl和pcDNA3，用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化；(5)动物实验：将4～6周龄雄性BALB／c小鼠随机分为5组，每组20只；5组分别为生理盐水对照组、空质粒对照组(pcDNA3

6、组)、pcDNA3／mlFN．Y对照组、pcDNA3／sVPl对照组及pcDNA3／mlFN．Y与pcDNA3／sVPl混合注射组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每中文摘要次每只接种100ug，每2周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第13天，断尾取血，分离血清，用微量中和试验(固定病毒．稀释血清法)检测血清中CvB3特异性中和抗体。第3次免疫后2周，用500TCID50的CVB3腹腔内攻击，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天。(6)小鼠接种病毒后第三天，无菌断尾取血，分离血清，测定血中的病毒滴度；

7、(7)病毒攻击后第5天，取不同处理组的心脏，制备石蜡切片，HE染色，观察各组小鼠心肌病理学改变。结果：(1)有丝分裂原ConA诱导的小鼠脾脏巨噬细胞总RNA提取物，经RT-PCR扩增出了mlFN-YcDNA。(2)构建了真核表达重组质粒pcDNA3／mlFN．Y，目的基因长度为468bp，与预期值相符，经测序，证明与报道的mlFN．Y基因序列一致；(3)每次接种后，各组血清中和抗体的平均效价分别为：pcDNA3／sVPl组1：10。1：23．78，1：28．28；pcDNA3／mlFN—Y与pcDNA3／sVPl混合组l：

8、9．66，l：24．62，1：29．28；pcDNA3组、生理盐水组和pcDNA3／mIFN—Y组各次平均效价均低于1：5。对pcDNA3／sVPl组和pcDNA3／sVPl与pcDNA3／mlFN．Y混合质粒注射组每一次免疫后的抗体效价进行单因素方差分析，结果显示各组第二、三次免疫后的抗体效价与第一次