人类白细胞介素15与柯萨奇病毒b3型vp1基因双表达质粒的构建及免疫作用的研究

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1、中文摘要人类白细胞介素15与柯萨奇病毒B3型VPl基因双表达质粒的构建及免疫作用的研究摘要目的：怕细胞介素15(Interleukin．15，IL．15)是1994年由Grabs宙in等在检测猴肾表皮细胞系(CV．1／EBNA)上清液中的细胞因子时发现并克隆出来，其mRNA在胎盘、骨骼肌、肾脏和活化的单核巨噬细胞中可检测到，它与白细胞介素2(IL．2)没有序列同源性，但可与IL．2受体(IL．2R)的0和Y链相互作用，表现出许多与IL．2相似的生物学活性：体外诱导植物血凝素(PHA)刺激的正常外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤细胞咖()和B细胞的增殖，以及细胞毒T细胞(CTL)和淋巴

2、因子激活的杀伤细胞(LAK)的生成，并且IL．15还可以自分泌方式调节单核巨噬细胞分泌细胞因子，活化中性粒细胞，并延迟中性粒细胞的凋亡。IL．15还是T细胞趋化因子，因此在初始免疫反应阶段比IL．2更重要，可以促进免疫应答由初始免疫反应向适应性免疫反应过渡，增强免疫应答的强度。柯萨奇病毒B3型(CoxsackievimsB3。CVB3)是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原体。CVB3的VPI蛋白抗原性较强，可刺激机体产生具有保护作用的中和抗体对本研究的目的为，构建CVB3一VPl／IL．15基因的真核表达重组质粒，并观察其免疫效果，为研制防治病毒性心肌

3、炎的核酸疫苗奠定基础。中文摘要方法：从人胚肺二倍体细胞(2BS)中提取IL．15的mRNA，用自行设计的人IL．15特异性引物进行RT．PCR扩增，将扩增产物与pGEM．Teasy载体连接，转化DH5a大肠杆菌，于含氨苄青霉素的2YT培养基上筛选重组子，提取质粒进行酶切鉴定和测序。取双酶切的目的基因片断，与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建成真核表达重组质粒pcDNA3一IL-15。用自行设计的引物从pcDNA3．vPl质粒上扩增出带有启动子的VPl基因，插入到pcDNA3．IL．15质粒上，构建成真核重组质粒pcDNA3一VPl／IL．15，转化

4、DH5a大肠杆菌，经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫Balb／c小鼠，每只lOOug／次，共注射3次。每次免疫后的第六天，断尾取血检测CVB3中和抗体。3次免疫后用致死量(800TCID50)的CVB3感染小鼠，观察pcDNA3-VPl／IL．15对小鼠的免疫保护作用。结果：构建的pcDNA3．VPl／IL．15重组质粒目的基因与CVB3-VPI和IL．15的标准序列相同：pcDNA3-VPl／IL-15重组质粒免疫小鼠后，能诱导机体产生中和抗体，各次免疫后抗体滴度分别为<1：5、l：8．7和1：40。用800TCID50CVB3感染小鼠，pcDNA3一VPl／IL．15重组质粒免疫组、p

5、cDNA3．IL．15+pcDNA3．VPl、pcDNA3-IL-15、pcDNA3．VPl重组质粒对照组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组，2l天生存率分别为35％、30％、10％、25％、15％、10％，经x2检验，6组小鼠生存率无明显差异(P>o．05)05-．．结论：本研究成功地构建了人白细胞介素15基因重中文摘要组真核表达质粒pcDNA3．IL．15；首次构建了柯萨奇病毒VPl基因和人白细胞介素15基因双表达质粒pcDNA3一VPl／IL一15；用pcDNA3-VPl／IL-15、pcDNA3一IL-15+pcDNA3．vPl、pcDNA3．VPl、重组质粒肌肉注射免疫

6、雄性4-6周龄BALB／c小鼠，三周后检测到了低水平的中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高；用致死量的CVB3(800TCID50)攻击pcDNA3．VPl／IL．15免疫三周的雄性4-6周龄BALB／c小鼠，诱导机体产生的抗体不能保护小鼠抵御CVB3的攻击。推测延长免疫时间，可增强本基因疫苗的免疫应答。关键词：白细胞介素15{pcDNA3；pcDNA3．VPl／IL．15质粒；柯萨奇病毒B组3型，免疫应答；小鼠一英文摘要TheConstructionofDoubleExpressionPiasmidpcDNA3—-VPl／IL-·15andStudyonitsImmuneEffec

7、tABSTRACTobjective：Interleukin．15(IL一15)wasfoundandclonedfrommonkeykidneyepidermiscell(CV-1／EBNA)byGrabsteinin1994．ItsmRNAwasdetectableinplacenta、skeletalmuscle，kidney，activatedmonocyteandmacrophage．Althoughitssequencesareno