柯萨奇病毒b3 vp1蛋白的原核表达及免疫效果观察

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2、不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。．研究生签名：窖书导师签名：互丧蟀伽年弓月到羽中文摘要柯萨奇病毒B3YPl蛋白的原核表达及免疫效果观察摘要目的：柯萨奇病毒的B组(CVB)是人类病毒性心肌炎的主要病原体，以CVB3最为重要，迄今尚无有效的防治手段。VPl是CVB3的主要衣壳蛋白，含有多个T、B细胞表位，可诱导机体产生免疫应答。研究表明，编码VPl的DNA疫苗能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答，并对感染小鼠具有一定的保护能力，但不能有效阻止致死量病毒感染。推测与DNA疫苗在体内进入

3、细胞的量较少，目的基因表达水平较低有关。研究表明，蛋白质有很强的免疫原性，免疫动物可诱导产生高效价的抗体。据此，许多人又重新尝试用蛋白质做为疫苗以提高免疫效果。此种疫苗是提取病原体中具有免疫保护作用的蛋白，或利用DNA重组技术使重组体表达这类蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗，称为亚单位疫苗。亚单位疫苗不含有感染性组分，无须灭活，也无致病性。自1981年成功地将口蹄疫病毒的VP3基因克隆到大肠埃希氏菌内并制成用于牛和猪的疫苗之后，迄今已研制出包括乙型肝炎疫苗在内的许多亚单位疫苗用于传染病的预防。但也有研究表明，某些病原体亚单位疫苗的免疫原性低

4、，不能达到满意的免疫保护作用。近年有研究显示，采用prime—boost方法将亚单位疫苗与DNA疫苗联合应用能明显提高疫苗的免疫效果。本研究用原核表达系统中表达CVB3VPl蛋白，单独或采用prime．boost方法与CVB3VPlDNA疫苗联合应用免疫小鼠，观察免疫效果。中文摘要方法：1利用我室前期构建的真核表达质粒pcDNA3／VPl为模板，用VPl基因的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物与pGEM．T载体连接，转化入DH5a大肠杆菌，提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选重组子。2经酶切鉴定和测序确认后，取双酶切的VPl片段和经过同样两

5、种酶酶切的原核表达载体pET-his连接，构建原核表达质粒pET-his／VPl。3将原核表达质粒pET-his／VPl转入表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达携带有6xHIS标签的VPl蛋白，分别利用HIS单抗和CVB3多抗经Western．blot鉴定无误后对目的蛋白进行初步优化表达。将大量诱导表达后的菌体在冰浴中超声破碎，分离上清和包涵体沉淀，对该蛋白的水溶性进行分析。将包涵体溶液进行SDS，PAGE，切下目的条带，透析袋中透析。定量所得纯化后的蛋白。4用碱裂解法从转化的DH5a大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3／VP

6、l，用聚乙二醇沉淀法进行纯化。5动物实验：将6,-一8周龄雄性BALB／c小鼠随机分为5组，分别为PBS对照组、pcDNA3NPI质粒组、VPl蛋白组、pcDNA3／VPl质粒初免—ⅣP1蛋白加强组(以下简称质粒蛋白组)和VPl蛋白初免～pcDNA3／VPl质粒加强组(以下简称蛋白质粒组．)，每组18只；纯化后的质粒用PBS稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，纯化后的蛋白以PBS稀释后，腹腔注射免疫小鼠，初次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂。每次每只接种lOOgg；每3周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第14天，内眦静脉取血，分离

7、血清，用微量中和试验(固定病毒．稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中和抗体的水平；第3次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液，采中文摘要用细胞计数试剂盒(cellcountingkit-8，CCK．8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)杀伤活性的检测；另每组12只小鼠用致死量的CVB3(4LD50)进行腹腔注射，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第2l天；每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击，注射病毒后第7天处死，用于血中病毒滴度的测定。结果：1用PC

8、R从质粒中扩增出VPl基因片段，DNA测序证实此基因片段与报道的基因序列～致。2成功构建了原核表达质粒pET-his／VPl，双酶切结果证实插入和连接均正确。3在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中成功表