人共信号分子b7h3在炎症反应及肺癌肿瘤免疫逃逸中作用机制的研究

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1、苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：i匿垫邀日期：导师签

2、名：互迄盔＆日期：-，。l≈3／蛸阻■阻指导小组成员：卢斌峰博士王江淮博士严俊博士人共信号分子B7．H3在炎症反应以及肺癌肿瘤免疫逃逸中的作用机制研究中文摘要中又捅斐作为新近发现的共信号分子，B7一H3在T细胞免疫应答中的作用还存在较大争议，这也提示该分子功能具有多样性。与功能相比，B7一H3表达谱比较明确。该膜分子可在肿瘤组织以及诱导活化的单核巨噬细胞表达，且与临床进展密切相关。如前所述，共信号分子通常存在膜性以及可溶性两种形式，那么是否也存在可溶性B7一H3，有何临床意义?除可以调控T细胞免疫应答外，最近发现B7一H3也可调控其他组织细胞的生物学行

3、为，那么B7一H3是否可以参与调控单核一巨噬细胞生物学功能，其机制如何?B7一H3在多种肿瘤组织呈异常高表达且与临床进展密切相关，那么肿瘤微环境中髓系来源细胞是否也表达该分子，表达的临床意义及作用机制如何?针对上述问题，本论文开展如下研究：第一部分：可溶性B7一H3的生物学特性及其检测的临床意义目的：研制sB7一H3定量检测试剂盒，鉴定人体内是否存在sB7．H3，并分析其生物学特征及其检测的临床意义。方法：利用自主研发的抗人B7一H3单抗4H7和21D4双夹心法配制sB7一H3ELISA检测试剂盒。在此基础上，检测不同年龄阶段健康人血清(血浆)中sB7

4、一H3含量。检测外周血免疫细胞如树突细胞、淋巴细胞、单核细胞以及长期细胞株等膜型以及培养上清中可溶性B7一H3表达水平，并利用金属蛋白酶抑制剂进行干预，分析sB7一H3产生的可能机制。利用Western—blotting实验分析浓缩细胞培养上清中sB7一H3分子量，并利用流式细胞技术，分析该浓缩天然sB7一H3是否可与体外活化的T淋巴细胞结合，分析该天然形式sB7一H3是否为功能片段。筛查不同疾病状态下sB7一H3表达水平，分析该可溶性分子表达的临床意义。结果：利用抗B7一H3单抗4H7为包被抗体，生物素标记单抗21D4为检测抗体，成功构建sB7一H3

5、ELISA试剂盒。该试剂盒检测区间为27—20，000pg／ml，线性检测区间为20—1，600pg／ml。准确性，灵敏度都达到同类产品国际水平。利用该试剂盒，我们发现人体内存在天然形式的sB7一H3，且不同年龄阶段水平不尽相同，中文摘要人共信号分子B7．H3在炎症反应以及肺癌肿瘤免疫逃逸中的作用机制研究以脐带血水平最高，成年后则无明显变化。检测健康人外周血单个核细胞以及体外培养的树突细胞，我们发现健康人外周血免疫细胞几乎都检测不到膜型B7_H3表达，但是在体外诱导活化的T淋巴细胞、单核细胞以及树突细胞则能同时检测到膜型B7一H3以及sB7一H3表达。

6、因此，我们推测膜B7一H3可能是sB7一H3来源。金属蛋白酶抑制试验中也证实MMPs参与了sB7一H3表达调控。Western—blotting证实该可溶性分子大小约为16．5kDa。竞争抑制试验表明该天然形式可溶性分子且可与活化T细胞结合，证明其为具有生物学活性的功能片段。临床检测发现，sB7一H3在细菌引起的炎症性疾病患者体内水平显著升高，而在病毒性感染患者sB7一H3则未见明显变化。结论：成功构建可以定量分析sB7一H3的ELISA试剂盒，证实人体内存在天然形式sB7一H3，其来源为金属蛋白酶剪切而来的膜型B7一H3，在细菌性感染患者体内明显升高

7、，具有临床检测意义。第二部分：B7一H3协同TLR2／TLR4信号通路促进脓毒症炎症反应的机制目的：研究共信号分子B7一H3对单核巨噬细胞的调控作用，分析该分子在炎症应答中的作用机制。方法：临床标本分析脓毒症患者外周血淋巴细胞及单核细胞上B7．H3R表达，并分析B7一H3R表达的调控机制。在此基础上，利用小鼠B7．H3Ig融合蛋白以及抗小鼠B7一H3阻断型单抗，研究炎症反应条件下B7一H3对骨髓来源巨噬细胞的调控作用。构建TLR一2以及TLR4基因过表达工程细胞株293，分析B7一H3发挥生物学作用是否依赖于TLR2／4信号。此外，构建内毒素动物模型，

8、利用抗B7一H3抗体进行体内干预，分析B7一H3体内炎症应答中的生物学作用及对疾病进展的影响。