氧化油脂对草鱼肝细胞损伤机制地研究

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3、海海洋大学硕士学位论文氧化油脂对草鱼肝细胞损伤机制的研究摘要试验一草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝细胞分离与原代培养离体培养的肝细胞在短期内形态和功能会发现显著变化，为探讨其在这变化期间的最佳功能状态，在不同条件下进行原代培养，以探讨适合草鱼肝细胞生长的最佳条件及培养方法，用于饲料营养与非营养物质对草鱼肝细胞代谢、损伤作用机制的研究。采用改进的胰蛋白酶消化法和红细胞裂解液分离、纯化肝细胞，置于已配置好的M199培养基中进行原代培养。通过显微镜计数法和台盼蓝排斥法计算细胞产量

4、和存活率；MTT比色法连续测试培养6d肝细胞的活力；荧光显微镜观察其形态结构变化，并收集不同时期培养液上清，检测肝细胞白蛋白分泌、尿素合成功能和LDH释放量。结果显示采用0.25%浓度的温胰蛋白酶消化法，消化20min，分步收集肝细胞，经台盼蓝染色检测和血球计数板计数，活细胞数≥99%。在含10%胎牛血清、610μg/mL胰岛素的M199培养基中，以接种浓度1.7×10cell/mL左右为宜，置于27℃、4.5%CO2浓度的恒温培养箱中可成功培养草鱼原代肝细胞。MTT实验结果显示在培养第2d时A值

5、最高，细胞处于最佳状态。荧光纤维镜下可见肝细胞成多边形生长，细胞周围有大量伪足伸出，使其贴壁更加牢固，细胞间隔清晰可见，高倍镜下可见圆形细胞核。细胞可生长10d以上。肝功能检测结果显示24~72h阶段细胞增殖能力强，LDH含量显著性降低(P<0.05)，BUN含量明显增加I上海海洋大学硕士学位论文(P<0.05)，白蛋白含量呈上升趋势。此阶段肝细胞生长状态最好，适合用于肝细胞代谢、损伤及基因表达的研究。试验二氧化豆油水溶物对草鱼肝细胞损伤作用的研究本研究以草鱼原代培养的肝细胞为试验材料，研究不同浓

6、度和不同作用时间氧化豆油水溶物对草鱼肝细胞的毒理影响。通过测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量，采用油红O和碱性磷酸酶染色以及透射电镜等方法检测和观察肝细胞的生长变化。结果显示高浓度（0.22656、0.15104g）组氧化豆油水溶物作用3h就可导致草鱼肝细胞形态发生明显变化，LDH释放量增加，T-AOC能力提高，MDA含量较高。草鱼肝细胞的损伤程度与水溶液的作用浓度和时间存在显著性关系，高浓度组与对照组相比损伤严重，随着时间的延长肝细胞加剧凋亡。试验

7、三氧化豆油水溶物对草鱼原代肝细胞相关基因表达活性的影响以原代培养24h的草鱼肝细胞为研究对象，添加0.22656g氧化豆油所含水溶物，分别作用1、1.5、2、2.5和3h，收集草鱼肝细胞样品，探讨氧化豆油水溶物对肝细胞的损伤作用。采用实时定量反转录聚合酶链式反应（qPCR）方法，检测草鱼肝细胞IGF、PPAR-α、PPAR-γ、FAS、PGC1-α、SCD1、UCP2的mRNA表达量。各试验组的IGF-Ⅰ、UCP2、PGC1-α、PPAR-α基因表达量与对照组相比，均呈现显著性下调（P<0.05）

8、；FAS、SCD1、PPAR-γ的基因表达量与对照组相比，均呈现显著性上调（P<0.05）；且各基因试验组中2.5、3h各基因表达量与1h相比有显著变化。可能是由于添加的氧化豆油II上海海洋大学硕士学位论文水溶性成分如FFA、MDA使FAS基因表达上调，而PGC1-α、PPAR-α的表达量都下调，细胞脂质代谢受阻，细胞出于自我修复，PPAR-γ和SCD1基因表达上调，这种抑制与修复的相互作用致使试验组各基因表达量在不同时间出现下调或上调的变化。关键词:草鱼,肝细胞,原代培养,氧化豆