10-第十章遗传工程

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1、第十二章遗传工程一、遗传工程的概念遗传工程（geneticengineering）是七十年代发展起来的一门新技术，它是综合分子生物学与微生物学、分子遗传学等理论和技术建立起来的。广义：基因工程、细胞工程、染色体工程和细胞器工程。狭义：基因工程1、基因工程（geneengineering）:不是通过--般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室操作技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。■基因克隆与表达■转基因动植物2、基因工程的优越性■传统杂交只

2、能进行亲缘关系较近的交配（远缘交配失败），无法进行远缘交配（即遗传物质交流），遗传物质交流开始是全方位的，通过人为对性状选择，达到改良目的，但工作量大，且容易改变其他原有优良性状■基因工程不但可以进行种间、属间科间遗传物质交流，还可以进行高等、低等，动物与植物间遗传物质交流，同时可以定向而不改变原來的优良性状3、基因工程主要在以下儿方面应用a.生物制药b.遗传病治疗:疾病动物模型c.农业新甜种选育d.发酵工程e.治理环境污染（创造微生物新类型）4、基因工程施工的程序（1）.施工准备材料，即目的基因，载体和工具酶等。（2）.把目的基因与载体连接

3、成重组DNA（3）.把重组DNA分子引入受体细胞，即基因转移，建立分子无性繁殖或称克隆。（4）.鉴定筛选携带并表达了目的基因的个体和家系二、基因工程的四大要素及实施要点（一）目的基因的克隆（分离）1•化学合成1970年Khorana首次合成酵母丙氨酸tRNA的基因1976年合成第一个有生物活性的基因，大肠杆菌酪氨酸tRNA的基因基因化学合成首先要了解该基因的核昔酸顺序，然后才能合成。2.PCR扩增：已知基因的全部或部分序列时，可根据已知序列设计引物扩增目的基因•PCR的四大要素：•模板DNA：含有目的基因•引物：根据已知序列设计•dNTPs:

4、dATPdCTPdTTPdGTP合成DNA的原料・TaqDNA聚合酶及其缓冲液：Mg2+•PCR扩增的反应条件和步骤：•预变性：94~95oC5分钟・变性：94~95oC1分钟・复性：30-68oC(根据引物Tm确定)0.5-2分钟・延伸：72oC0.5~2分钟(根据扩增片断长度确定)2.逆转录PCR(RT-PCR)•cDNA：互补DNA(complementaryDNA)•从cDNA文库中获得全长目的基因某一时期特定组织基因转录形成的mRNA总体反转录成cDNA,这些cDNA全部克隆就称为cDNA文库。从cDNA文库中获得目的基因需要用标记

5、探针对其进行杂交和筛选，■用目的基因片断制备探针(PCR或克隆)■用放射性或者荧光物质标记探针■与cDNA文庄杂交，获得阳性克隆■扩增分离完整目的基因3.从基因组文库中分离•基因组文库：将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段同相应的载体连接、克隆，所产生的克隆群体代表基因组DNA的所有序列。从基因组文库中可以筛选获得完整的基因组DNA序列(包括内含子)常用构建基因组文库的载体和宿主主要有：■BAC(bacterialartificialchromosome)细菌人工染色体，以细菌作为宿主，将DNA片段与质粒重组后转入

6、细菌中繁殖。■YAC(yeastartificialchromosome)酵母人工染色体，以酵母作为宿主。■PAC(PIartificialchromosome)噬菌体人工染色体，以噬菌体作宿主(二)重组DNA的建立为了实现基因转移，首先需要限制酶将“冃的”基因安装在一个特定的运载工具——载体DNA上，在载体DNA的运载和保护下，被转移的基因可以通过适当方法顺利进入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，最后整合到染色体上，达到稳定表达。1.运载工具…■载体•作为运载工具的条件O在宿主细胞中能白我复制，并能稳定地将所携带的外源DNA在受体细胞内忠实

7、地复制。O有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因，并能嵌入外源DNA的片段。O具有可作为重组DNA分子选择标记遗传标记。•原核生物载体的种类有多种载体，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。O质粒载体：环状DNA,大小Ikbp到200kbp。以细菌质粒(plasmid)的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。a.pBR322质粒，b.pUC18/19质粒c.pGEM系列多功能载体a.pBR322质粒，广泛应用。特征：(a)有36个单一的限制性内切酶位点,(EcoRl,

8、HindHI等)(b)四环素抗性基因Te化外源DNA片段插入到BamHI位点时，使Tef失活，可以通过AmprTets来筛选重组体。•真核生物载体真核载体与原核的不