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《肝硬化患者外周血单核细胞中dcr3基因表达的意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、肝硬化患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义杨光松原市长岭县人民医院(吉林长岭131500))【摘要】目的探讨外周血单核细胞(PBMC)中DcR3基因表达水平与肝硬化的关系。方法64名肝硬化患者和60名健康对照者各取5ml静脉血，肝素抗凝，密度梯度离心法分离PBMC,TRIZOL法提取PBMC总RNA,用半定量RT-PCR法检测PBMC中DcR3基因的相对表达水平，并用t检验进行比较。结果肝硬化患者组PBMC中DcR3基因的相对表达水平为0.398±0.034，与正常对照组(0.246±0.023)相比有明显差异(P<0.05)
2、o结论肝硬化患者PBMC中DcR3基因的表达水平增高。【关键词】DcR3基因表达肝硬化外周血单核细胞［中图分类号］R575.2［文献标识码］A［文章编号］1810-5734(2010)11-0087-02肝硬化的发病机制尚未完全阐明，但大量的资料表明肝硬化与自身免疫有关。而Fas/FasL系统介导的凋亡功能紊乱在某些自身免疫病的发病中起重要的作用［1］。新近发现一个可溶性受体蛋白诱惑受体3(decoyreceptor3)能竞争性地与FasL结合，从而阻断FasL诱导的凋亡，因此可能使Fas/FasL功能失调，在自身免疫病及肝硬化发病中起一定的作用［2］o本实验采用R
3、T-PCR法检测DcR3基因在肝硬化患者及健康人外周血单核细胞(PBMC)中的表达，以探讨其表达与肝硬化的关系。1材料与方法1.1主要试剂及仪器：十二烷基肌氨酸钠、DEPC购自Sigma公司，Oligod(T)、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、细胞分离液等购自Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。德国高速低温离心机HERMLEZ383，凝胶电泳成像分析系统TannonGISlOOO(Tannon有限公司，上海)，深低温冰箱Formo(USA),恒温水浴箱DK28D(上海医用恒温设备厂),PCR仪FeroTec(杭州PCR仪有限
4、公司)。1.2研究对象:肝便化患者64例，男38例，女26例，年龄35〜70岁，平均52岁。全部病人均经肝CT、及肝功能功能检查确诊，且未经治疗。健康对照组60例，男35例，女24例，年龄20〜65岁，平均46岁。1.3实验方法1.3.1PBMC分离:研究对象各取静脉血5ml,肝素抗凝;加入含5ml淋巴细胞分液的离心管中，离心2000r/minz20min,可见血浆与分离液的界面上有一白膜层，此即所需的PBMCO吸出细胞至另一试管用生理盐水洗3遍，离心2000r/min,5min,弃上清。1.3・2RNA的提取及RT-PCR：在上述PBMC标本中加入变性裂解液Tri
5、zol1ml吹打使细胞充分溶解，置室温5min后加入氯仿200μl,剧烈震荡15s,室温5min,4°C12000rmin离心15min,取上清加入等体积的异丙醇，混匀后・20°Clh,4°C12000r/min离心10min,弃上清，加入75%乙醇1ml,4°C7500r/min离心5min,吸去乙醇自然干燥10〜20min?溶于:L0μIDEPC水中。此即人外周血总RNA。在上步得到的10μl模板RNA中，加入lμIDEPC水，lμl引物Oligod(T),稍离心，100°C沸水1min;加入2μldNTP,4μl5&t
6、imes;buffer,2μIAMV逆转录酶,稍离心，42°C水浴90min；沸水3min,灭活AMV,得到总cDNA。聚合酶链反应PCR扩增DcR3基因(214bp)和β-actin基因(570bp)。引物序列：DcR3基因引物正义链为5′-TCAATGGCCAGGCTCTTC-3′,反义链为5′-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3′;β・actin基因引物正义链为5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′,反义链为5&prim
7、e;-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG-3′。1.3.3PCR产物的相对定量分析：5μlPCR产物经1.5%的普通琼脂糖凝胶电泳后畀臭化乙呢染色，通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析，把DcR3/β2actin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。2结果结果显示，健康对照组和肝便化患者PBMC中均检测到DcR3基因的表达，PCR产物电泳后在214bp大小位置均见有一清亮条带，与预计的DcR3基因片段大小一致，同时在570bp大小位置也显示有清亮条带，此为内参照基因β-
