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《肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、【中图分类号】R574【文献标识码】A【文章编号】1561-5464(2010)-05-0385-03【摘要】目的建立随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)分型技术，对肠球菌进行基因分型，探讨RAPD在分子流行病学中的应用，并探讨肠球菌的基因分型及其与耐药性的关系。方法对医院临床标本中分离的64株肠球菌进行RAPD基因分型，并分析基因型与耐药性的关系。结果RAPD分型结果显示，经优化的RAPD分型技术能有效地对肠球菌进行基因分型，分型率为100%o64株肠球菌根据扩增片段的差
2、异分为8种基因型。以I、II、IILVU型为主，共占81.4%。I、Vffl型具有对B内酰胺类抗生素和高水平氨基糖昔类抗生素耐药。IV型具有对B?-内酰胺类抗生素耐药。III、vn具有对高水平氨基糖昔类抗生素耐药。II、V、VI型具有对B?-内酰胺类抗生素、高水平氨基糖昔类抗生素、糖肽类抗生素敏感。结论RAPD分型技术是一种特异、敏感、简便快速、分辨力强、分型率高、重复性好的分型方法。可有效地对肠球菌进行基因分型,并且肠球菌的RAPD分型与其耐药性有一定关系。【关键词】肠球菌;随机扩增多态性DNA;基因分型肠球菌的感染和耐药性是
3、目前国内外关注的重要课题和难点。美国疾病控制中心(CDC)医院感染监测系统(NISS)调查表明肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一，并且肠球菌的分离率不断上升。尤其多重耐药(MDR)肠球菌的出现，特别是高水平氨基糖昔类耐药(HLAR)肠球菌以及耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现，其耐药性和耐药水平越来越高,成为抗感染治疗的新挑战。近年来,随着分子生物学技术的发展，具有分辨力强、分型率高和重复性好的RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究，并显示出较好的应用前景。RAPD分型法是1990年内Williams和Welsh等建
4、立的一种以PCR为基础的提示基因同源性和基因多态性的方法，该法最大特点是可对模板序列未知，而随机引物可以是任意的单链寡聚核昔酸片段。同时可通过在RAPD分型的基础上，进行与其耐药性关系的研究，可在基因水平上对临床细菌的耐菌性进行测报。因此，肠球菌的基因分型鉴定对于其流行病学分析和感染控制具有重要意义。为此，我们收集临床分离的64株肠球菌进行RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究现报告如下。[1-4]1材料与方法1.1菌株2006年6月至2009年10月本院住院患者的尿液、痰液、大便、分泌物、胆汁、前列腺液、血液等临床
5、标本中分离的64株肠球菌，已经系统鉴定。1.2细菌DNA的提取将64株肠球菌分别接种于血平板,35°C培养18〜24h。用接种环将菌落分别接种于5ml的普通营养琼脂(LB)液体培养基中,35°C恒温摇床过夜，取1.5ml菌液离心收取菌体,酚氯仿法抽提后DNA,分光光度法测定抽提后DNA的纯度,A260/A280为1.82〜1.98之间，符合DNA样品要求，置-20°C冰箱保存备用。1.3RAPD反应体系条件的优化1.3.1引物的设计RAPD引物共6条,5条为10bp的引物,1条为9bp的引物。序列15’-GAAGTCGTLL-3
6、'，序列25’-TCACGCTGCA-37，序列35’-GGAGGGTGTT-3z,序歹J45z-AGGGAACGAG-37，序歹lj55‘-ACGCGLCCT-3,，序歹J65z-GGGATGGAAC-37。由上海生工生物工程公司提供。1.3.2RAPD引物、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶、循环参数的反应条件优化在50PIPCR反应体系中含被筛选的随机引物之一2Ul(10pmol/L),10Xbuffer5uIdNTPO.4ul(0.2mmol/L),Mg2+浓度1.5>2.0>2.5>3.0>4.0mmol/L,TaqDN
7、A溶酶1.5U、2.0U、？2.5U、3.0U,DNA模板5.0UI循环参数94°C预变性3min后，再经94°Clmin,35°Clmin,72°C2min各35、40、45、50个循环后72°C延伸5min,取5uI扩增产物加上2uI上样6Xbuffer，经1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5ug/mlEB染料)电泳,85〜100V电泳lh,同时用DNAmarker作标准，紫外分析仪下观察并拍照，进行RAPD结果比较，观察RAPD分型指纹图，确定RAPD分型技术的优化条件反应体系。循环参数为94°C预变性，再经94°Clmin>3
8、5°Clmin>72°C2min、45个循环后经72°C延伸5min0随机6株不同DNA指纹的样本在优化反应体系下重复检测3次，观察DNA指纹图谱。2结果2.1RAPD反应体系的优化2.1.1随机引物的筛选每次RAPD分析加入6条随机引物之一，结果显示引物AW9
