基于宏基因组学方法挖掘新型α-l-鼠李糖苷酶资源

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1、基于宏基因组学方法挖掘新型a-L-1李糖昔酶资源梁跃斌李彬春李艳琴山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室摘要：a-L-鼠李糖营酶是特异性切割末端含a-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖营水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。木研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法，从提取的健康人体粪便宏基因组DNA屮获得新型细菌源a7-鼠李糖苛酶基因。通过对CAZy数据库GII78家族屮193条细菌源«-L-鼠李糖昔酶氨基酸序列进行多重序列比对，首次将a-L-鼠李糖百酶家族分

2、为3个亚家族，并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段，对PCR产物克隆测序，结果获得12条a-1厂鼠李糖昔酶基因片段，对其编码的氨基酸序列在GenBank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,—条为73%,其余9条在94%以上。根据GenBank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物，以人体粪便宏基因组DNA为模板，扩增获得3条a-L-鼠李糖昔酶全长基因，并将其克隆于载体pET

3、-28a,在E.coliBL21(DE3)内进行异源表达，0的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中，少量以可溶性形式存在于上清屮。人体肠道细菌宏基因组为新型Q-L-鼠李糖昔酶基因发现提供了潜在的基因资源库，基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。关键词：a-L-鼠李糖背酶;肠道细菌;宏基因组;保守氨基酸基序;简并引物;作者简介:李艳琴,Tel:0351-7011499;E-mail:ya.nqin@sxu.cdu.cn收稿日期:2016-09-14基金：国家自

4、然科学基金项目(No.31400684)DiscoveringNovela-L-RhamnosidasesBasedontheMetagenomicApproachLIANGYue-BinLIBin-ChunLIYan-QinInstituteofBiotechnologyofShanxiUniversity,KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineeringofMinistryofEducation;Abstract：a-L-rhamnosidase

5、isakindofglycosidehydrolasewhichcleavesterminalaT厂rhamnosespecificallyfromalargenumberofnaturalproducts,itwasusedwidelyinthefood,medicine,chemicalandotherindustries.Wewanttoobtainthenovelbactcriala-L-rhamnosidasegeneswiththeapproachbasedontheconservedamino

6、acidmotifsofa-L-rhamnosidasefamilyanddegenerateprimersPCRfromthemetagenomicDNAwhichwasextractedfromhealthyhumanfeces.193aminoacidsequencesofbacteriala-L-rhamnosidasesbelongingtotheG1178familyfromtheCAZydatabasewereanalyzedbymultiplesequencesalignment.Thea-

7、L-rhamnosidasefamilywasfirstlydividedintothreesubfamiliesandtwopairsofconservedaminoacidmotifsfromtwosubfamiliesweredefined.Degenerateprimersweredesignedonthebasisoftheconservedaminoacidmotifs.Thegenefragmentsbetweenconservedmotifswereamplifiedbydegenerate

8、primersPCRwhichusedthetotalDNAfromfcccsmetagenomeasthetemplate-ThePCRproductswereclonedandsequenced.And12a-L-rhamnosidasegenefragmentswereobtained.Aminoacidsequencesencodedbythesegenefragmentswerealignedviabl