猪流感h1n1亚型神经氨酸酶点突变拯救毒株的研究论文

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1、猪流感(H1N1亚型)神经氨酸酶点突变拯救毒株的研究摘要猪流感(SwineInfluenza，SI)是猪流感病毒感染侵入猪群中，可引起传播流行的一种急性、热性及高度接触性呼吸道传染疾病。全球范围内都有发生此疾病，已遍布于北美洲、亚洲、欧洲与非洲等。其危害严重，造成了巨大的经济损失，并且对人类的身体健康构成了很严重的威胁。2009年发生在墨西哥和美国的猪流感风暴(Munstereta1．，2009)，引起了全球对s工的高度重视，再次敲响了公共卫生的警钟。猪流感本身所具有的种间传播特异性和猪体本身作为“孵化器”“重配器”“混合器”的特异性决定了猪流感病毒的重要

2、性和可研究性。位于流感病毒囊膜上的重要的表面糖蛋白之-t0经氨酸酶，在流感病毒出芽，子代病毒释放与扩散方面发挥了重要作用。在HA(血凝素)介导的病毒膜融合和病毒粒子感染过程中，NA(t0经氨酸酶)发挥了重要功能。有研究发现，神经氨酸酶发生突变会影响到其酶活性，进而影响病毒粒子的毒力。基于以上几点开展一系列的研究，主要研究内容如下：1．实验研究毒株的确立和细胞适应株的建立本研究选用的毒株是H1N1亚型猪流感病毒A／swine／TianJin／01／2004(H1N1)(以下简称TJ)，本毒株是2004年由实验室人员分离得到。通过对它的一些基本研究发现，TJ毒

3、株在细胞上的适应能力很差。基于此，通过对其在细胞上连续传代增殖，发现在传代3次后能够达到一个很稳定的血凝价水平，达到29。比原毒株相比，血凝价略微升高。将TJ毒株在细胞上适应后建立的适应株称为TJ细胞适应株。2．点突变感染性克隆的构建将TJ原毒株和细胞适应株八个基因通过测序发现在神经氨酸酶片段中有两个位点发生的突变(658和1254)，基于此构建了点突变的神经氨酸酶双向表达载体质粒。通过利用成熟的反向遗传操作技术平台，拯救出点突变病毒毒株，分别命名为TJNA658和TJNAl254。3．拯救毒株的毒力相关性研究首先，对拯救毒株做基本测定，发现TJNAl25

4、4拯救毒株比原毒株相比，表现出血凝价升高4倍，EID50增强，本研究还对拯救毒株进行鸡胚和BALB／c小鼠动物模型试验。结果中发现：与原毒株相比，TJNAl254和TJNA658毒株的毒力明显增强，华中农业大学2012届硕士研究生学位论文而且TJNAl254毒力增强的相对更明显些。同时还开展了检测攻毒小鼠肺组织中的细胞因子变化的相关试验，结果发现拯救毒株刺激细胞因子表现出增强趋势。最后，通过检测神经氨酸酶的相对活性，结果显示：点突变的神经氨酸酶基因蛋白的活性比原毒株的神经氨酸酶的活性增强。综上所述，本研究发现在神经氨酸酶片段上的1254位点改变，由G变为A

5、，氨基酸由M变为I，会使得神经氨酸酶的活性增强，并引起毒株的毒力增强。关键词：猪流感；神经氨酸酶；拯救毒株；鸡胚；BALB／c小鼠；毒力。猪流感(HINI亚型)神经氨酸酶点突变拯救毒株的研究AbstractSwineinfluenza(SwineInfluenza，s0isanacute，pigsinhotandhighlycontagiousrespiratoryinfectiousdisease．IthasbeenalloverNorthAmerica，Asia，EuropeandAfrica．Itsharmisserious，causedahugee

6、conomicloss，andposesasignificantthreattohumanhealth．In20090ccurredinMexicoandtheUnitedStatesswineflustorm(Munstereta1．2009)，onceagaincausedtheglobalSIattachesgreatimportancetoswineflu，soundedthealarmbell．Swinefluenzaitselfhastheinterspeciestransmissionandspecificityofporcinesomati

7、cthatasan”incubator’⋯heavyorchestration⋯mixer”．Thesespecificitydeterminantsofswineinfluenzavirusandtheimportanceofresearch．Influenzavirusneuraminidase，ininfluenzavirusenvelopeasimportantsurfaceglycoprotein，inbudding，progenyvirusreleaseanddiffusionplaysanimportantrole．IntheHA(hemag

8、glutinin)-mediatedvirusmembranefu