acalifonia072009亚型猪流感冷适应减毒疫苗株的拯救及免疫效果评价

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1、分类号R183.3学校代码10129UDC11.220学号2009301006A/Califonia/07/2009亚型猪流感冷适应减毒疫苗株的拯救及免疫效果评价RescueandImmunogenicEvaluationofAttenuatedVaccineCandidatefromA/California/07/2009申请人：段跃强学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：兽医药理学与毒理学指导教师：李培锋教授论文提交日期：二〇一三年六月摘要甲型H1N1流感病毒是甲型(A型)流感病毒引起的严重威胁人类健康的一种急性、呼吸道传

2、染性疾病。疫苗和药物是控制和治疗该病的主要措施。但从长远看，疫苗仍是控制流感传播的主要手段。流感疫苗有灭活和减毒两种，灭活流感疫苗据有较好的体液免疫效果，但细胞免疫、粘膜免疫效果较差。流感减毒活疫苗不但据有较好的体液免疫，而且细胞免疫及粘膜免疫效果也很好。近几年研究表明，细胞免疫及粘膜免疫在预防流感病毒的传播方面发挥着重要的作用，特别是激活机体的细胞免疫，能够增强疫苗对流感病毒的免疫保护效力。目前我国仅有灭活疫苗。因此，发展我国自主研制的流感减毒活疫苗就成为当前急需解决的问题。本研究应用反向遗传学技术，以A/AnnArbor/6/6

3、0ca(H2N2)型流感病毒做为骨架病毒，将其6个内部基因(PB1、PB2、NP、NA、M、NS)及WHO推荐的H1N1疫苗株-A/California/07/2009流感病毒HA、NA基因分别构建到双向表达载体pAD3000上，共转染MDCK～COS1细胞，得到冷适应、温度敏感、减毒的A/California/07/2009ca(CA/AAca)感病毒。通过基因鉴定、抗体中和试验、IFA及病毒在MDCK细胞的培养等方法对重配病毒的生物学特性、型别、表型进行了鉴定。通过鸡胚培养建立了2级毒种库，并应用无菌试验、支原体检测、外源因子检

4、测等方法证明重配病毒的毒种可以做为疫苗毒种应用。在此基础上，重配CA/AAca流感病毒免疫的BALB/c小鼠及雪貂，应用TCID50、间接ELISA、MTT、HI等方法对CA/AAca流感病毒进行了体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫应答效果的评价以及对小鼠、雪貂的免疫保护效力的研究。结果:1病毒的拯救及鉴定：构建了pAD3000-HA和pAD3000-NA质粒，并与A/AnnArbor/6/60ca(H2N2)型流感病毒的6个内部骨架组成8质粒，应用反向遗传学技术拯救出的CA/AAca病毒，经鉴定CA/AAca病毒为A/Californi

5、a/07/2009亚型，并且具有冷适应性、温度敏感的表型。2毒种库的鉴定及病毒纯化：建立了二级疫苗用CA/AAca病毒种子库，其血凝5效价均为1：256，经鉴定无细菌、支原体、外源因子污染。病毒接种时10倍稀释、稀释液为PBS、培养时间72h、培养温度33℃，并用蔗糖密度梯度离心的方法初步纯化了CA/AAca流感病毒。3CA/AAca流感病毒免疫应答效果的研究：（1）TPCK胰酶依赖性的检测应用TCID50检测BJ501病毒及CA/AAca病毒的毒力，加入TPCK胰酶（0.8μg/mL）后，CA/AAca流感病毒TCID50升高1.

6、25，BJ501病毒TCID50无显著变化；经蔗糖密度梯度离心方法纯化流感病毒；纯化后CA/AAca病毒TCID50为9.3，BJ501病毒TCID50为7.5；CA/AAca病毒滴度免疫免疫BALB/c，6免疫的最佳剂量为1×10TCID50/20μL。（2）CA/AAca病毒滴鼻免疫BALB/c小鼠，以A/California/07/2009流感灭活病毒肌肉注射为对照，A/California/07/2009流感灭活病毒HI效价显著高于CA/AAca病毒滴鼻组（p<0.05），而IgA显著低于滴鼻组（p<0.01）；灭活病毒肌肉

7、注射组的IL-4水平显著高于滴鼻组（p<0.05），而IL-6水平两者差异不显著（p>0.05）；灭活病毒肌肉注射组IFN-γ水平显著低于CA/AAca病毒组（p<0.01）。（3）CA/AAca病毒免疫小鼠，鼻、肺中检测到较低滴度的病毒滴度，4d后病毒消失。BJ501病毒在小鼠鼻、肺中检测到高滴度病毒，免疫后9d全部死亡。CA/AAca流感病毒二免2周应用BJ501病毒攻毒，3d后鼻、肺、脾、肾、脑中未检测到病毒。小鼠存活率100%。（4）CA/AAca病毒、BJ501病毒滴鼻免疫雪貂，CA/AAca病毒组雪貂未发生明显的生理变化

8、，鼻腔3d后检测不到病毒的存在。BJ501病毒组出现感冒症状，并且1到7d鼻腔中均检测到较高的病毒滴度。CA/AAca病毒组免疫3d后在雪貂的鼻、肺、脑中未检测到病毒的存在，BJ501病毒组在雪貂的鼻、肺、脑中检测到较高病毒滴度。CA