浮萍对不同氮素形态和水平代谢响应 (1)

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重庆大学硕士学位论文浮萍对不同氮素形态和水平的代谢响应姓名：马晓霞申请学位级别：硕士专业：环境工程指导教师：高旭20120522 中文摘要摘要随着我国经济和社会的快速发展，由氮磷引起的水体富营养化的程度越来越严重，已经成为治理水体污染的难题。虽然传统的污水处理技术工艺成熟，处理效果理想，但造价和运行管理费用昂贵，限制其广泛应用，尤其是在小城镇、乡村等经济水平较差地区。近年来，浮萍修复水体技术具有能耗非常低、对污水中氮磷去除效率高和适应性广泛等优点，在国内外被认为是一种最佳的革新技术，逐渐成为国内外环境领域研究的热点之一。前期的研究主要侧重浮萍优势品种的筛选、浮萍对不同污水的处理效果以及浮萍的资源化利用，但是缺少对于富营养化限制因子氮素在浮萍处理系统中的迁移、转化的机理以及浮萍体内代谢酶的活性与氮素去除的关系的研究。本试验以浮萍(Lemnaminor)为对象，研究了浮萍对不同氨氮(NH4+一N)浓度(0～56mg／L)的吸收特征以及不同NH4+-N浓度对浮萍氧化应激反应的影响，还考察了不同浓度和不同形态氮素(NH4+-N和N03"-N)对浮萍的生理状况的影响，对认识浮萍净化水体的机理具有重要意义，也为浮萍生态修复技术的推广和应用提供一定的理论依据和技术支持。主要研究结论如下：11浮萍对NH4+-N的吸收动力学特性可用Michaelis—Menten方程(M．M方程)来描述，通过回归方程得到最大吸收速率为0．0733mg·g～FW·h～，亲和力常数为1．4409h～。随着NH4+-N浓度的增加，浮萍体内可溶性蛋白(SP)、叶绿素和过氧化物酶(POD)活性均呈现先增大后减少的趋势，在3mmol／L时达到最大；超氧化物歧化酶SOD和丙二醛(MDA)含量则呈现出先降低再升高的变化特征，在3mmol／L时达到最低值。试验表明，浮萍在0．5至3mmol／LNH4+-N浓度范围均能正常生长；当NH4+-N浓度大于3mmol／L时，浮萍虽然表观生长正常，但酶学指标却表明NH4+-N对浮萍产生了胁迫效应，此时SOD活性的大小可以用于指示浮萍受到高浓度NH4+-N胁迫的程度。21随着培养时间的延长，浮萍吸收培养液中NH4+-N用于合成自身生长所需的物质，使其生物量增加：浮萍对NH4+-N的吸收速率及其增长速率均呈现出先增加后降低的趋势，并与浮萍体内的叶绿素、SP含量和谷氨酰胺合成酶(GS)活性变化趋势一致。在不同的初始浓度下，NH4+-N浓度对浮萍体内光合色素影响不大：随着初始浓度的增加，刺激浮萍体内GS活性的增加，进而提高了浮萍对NH4+-N的同化能力，促进氨基酸和SP的合成。根据相关性分析可知：浮萍体内SP与叶绿素含量存在极显著正相关关系；低浓度NH4+-N浓度处理下，浮萍体内SP含量与生物量呈现显著负相关关系；高NHn+-N浓度处理下，浮萍体内GS活性与叶绿 重庆大学硕士学位论文素含量之间呈显著或极显著正相关关系。3)随着培养时间的延长，浮萍吸收培养液中N03"-N使其生物量增加；浮萍对NOf-N的吸收速率及其增长速率呈现出先增加后降低的趋势；浮萍体内硝酸还原酶(NR)活性发生显著变化，而叶绿素、SP含量和GS活性变化不显著。高的初始浓度可诱导NR活性的提升，促进光合色素的合成，但对SP和GS活性影响不大。相关性分析结果表明：浮萍体内叶绿素与SP含量关系密切；高N03。．N浓度利于提高NR．活性，促进浮萍体内SP和叶绿素的合成。关键词：浮萍，吸收特征，氧化应激，同化，酶活性本学位论文的研宄工作在“国家科技重大专项(2009ZX07104．002)和重庆市环境保护局环保科技计划项EI(2011第12号)’’资助下完成，在此对提供经费资助的机构表示感谢。 英文摘要ABSTRACTWiththerapiddevelopmentofeconomyandsocietyinchina，thedegreeofeutrophicationcausedbynitrogenandphosphoruswhichhasbecometheproblemofwaterpollutioncontrolismoreandmoreserious．Toconventionalsewagetreatmenttechnology,althoughtheirprocessesarematureandsatisfactory,thecostsofoperationandmanagementareexpensive，limittedthewiderapplication，especiallytotheundevelopedregions，includingsmalltownsandvillages．Inrecentyears，duckweedrestorationtechnologyhasbecomeoneofthehottestissuesintheenvironmentfieldforlowenergyconsumption，highefficiencyandwideadaptability．Thisnewecologicaltechnologyisregadedtobeaninnovationandpopulararoundtheworld．Thescreening，uptakeratesandresourseutilizationofdifferentduckweedspecieswereinvestigatedinthepreviousresearches．Therewerefewstudiesaboutthenitrogenmigrationandtransformationmechanisminduckweedtreatmentsystem，aswellastherelationshipbetweenmetabolicenzymeactivitiesandnitrogenremovalcharacteristics．Theabsorbtioncharacteristicandoxidativestressreactionofduckweed(Lemnaminor)toal'nmonum(NH4+-N)wasinvestigated，andtheimpactsofnitrogenspsciesandconcentrationsonthephysiologicalstatusofduckweedwerestudiedinthispaper,takingaccounttoindicatethepurificationmechanismtowasterwaterandprovidetheoreticalbasisandtechnicalsupportfortheapplicationofduckweedrestorationtechnology．Themainresultsareasfollows：1)ThekineticabsorbtioncharacteristicsofduckweedtoNH4+-NcouldbeillustratedwiththeMichaelis—Mentenequation(M-Mequation)．AccoringtothefittingresultsofM—Mequation，themaximumabsorptionratewas0．0733mg’g吖FW·h“andtheaffinityconstantwas1．4409h～．ThegrowthofduckweedcouldbeinfluencedbydifferentconcentrationofNH4+-N．Withincreasingofconcentration，thechangesofsolubleprotein(SP)，chlorophyllandperoxidase(POD)activitywereincreasedfirstlyandthendecreased，andthemaximumvaluewereallappearedat3mmol／L．ButthechangesofSODactivityandMDAwerejustopposite，withtheminimumvalueat3mmol／L．Whentheconcentration0fNH4+-Nchangedfrom0．5to3mmol／L，duckweedCangrownormally．buttheindicatorsofenzymologyshowedthatduckweedhadantioxidativeresponsetoNH4+-N，especiallYtohigherconcentrationthan3mmol／L．SODactivitycanbeusedtoindicatethestressbythehighconcentrationofNH4+-NtollI 重庆大学硕士学位论文duckweed．2)WiththeincreaseoftimeculturinginsomeNI-h十-Ntreatmentconcentrations，thebiomassofduckweedwereincreasedwiththedecreasingofconcentration；theuptakeratetoNI-h十-Nandgrowthrateofduckweedwereshowedtobethesametrend，increasingfirstlyandthendecreasing．Thechangesofchlorophyll，SPandglutaminesynthetase(G}S)activityalsoshowedthesame．Therelationshipbetweentheconcentration—ofNH4十-NandphotosyntheticpigmentofduckweedWasnotsignificant，butGSactivitywasincreasedwithstimulationofhighNH4十-N，whereasthemetabolismtoNI-h+-NwasspeedupandthesynthesistoaminoacidsandSPwerepromoted．Accordingtotheresultsofcorrelationanalyses，therewasasignificantpositivecorrelationbetweenSPandchlorophyll．SignificantpositivecorrelationbetweenGSactivityandchlorophyllinhighconcentrationwasobserved，aswellastherelationshipbetweenSPandBiomassinlowconcentration．3)WiththeincreaseoftimeculturinginsomeN03’Ntreatmentconcentrations，thebiomassofduckweedwereincreasedwiththedecreasingofconcentration；theuptakeratetoNOs‘-Nandgrowthrateofduckweedwereshowedtobethesametrend，increasingfirstlyandthendecreasing；Nitratereductase(NR)activityinduckweedchangedsignificantly，whiletherewaslittlechangestochlorophyll，SPcontentandGSactivity．HighinitialconcentrationslimittedtheenhancementofNRactivity，andpromotedthesynthesisofphotosyntheticpigments，whereastheadverseeffecttoSPandGSactivitywaslittle．Accordingtotheresultsofcorrelationanalyses，aclosecorrelationbetweenSPandchlorophyllwasobservedinthisstudy．TheNRactivitycouldbeimprovedbyhighNOs‘-Nconcentration，whilethesynthesisofchlorophyllandSPinduckweed"Waspromoted．Key’words：Duckweed，AbsorptionCharacteristics，OxidativeStress，Assimilation，EnzymeActivityThisworkwassupportedbytheNationalWaterPollutionControlandManagementTechnologyMajorProjectsofP．R．China(2009ZX07104—002)andtheEnvironmentalProtectionScienceandTechnologyProjectofChongqingEnvironmentalProtectionBureauinPRChina(2011-12)IV 1绪论1绪论联合国环境规划署(马经安等2002)对全球水体富营养化程度进行了调查，结果显示：在全球范围内，大约有30％以上的湖泊和水库均存在水体富营养化现象，不过各地区产生水体富营养化的程度不同，在温度高且干燥的地区尤为严重。在我国“十一五”期间，周生贤指出虽然受污水体的治理取得了一些显著成效，但是水环境的安全仍然面临着威胁。调查结果显示，在七大水系中，劣V类的水质断面就超过了20％，国家重点监控的部分湖库和河流频繁发生水体富营养化现象。大部分的湖泊、水库水域虽然还能满足我国用水的多种要求，但是由于人类活动的负面影响，水体富营养化已经影响了各类水体功能的应用，特别是导致了城市的水体饮用水源供水障碍，有时还会影响人类饮水安全。随着我国经济和社会生活水平的快速发展，由氮磷引起的水体富营养化的程度越来越严重，己成为水污染控制的难题。传统的污水处理工艺主要包括活性污泥法、氧化沟和生物滤池等技术，虽然这些技术比较成熟，处理效果也比较理想，但是它们的造价和运行管理费用比较昂贵，从而限制了它们的广泛应用，尤其是在小城镇、乡村等经济水平较差地区的应用。自20世纪70年代以来，许多研究者们以大型的水生植物为研究对象，进行了污水处理和水体修复的研究应用。在众多水生植物中，浮萍是被研究应用较多的种群之一。大量实际工程的研究结果显示，浮萍的生长和利用几乎不受地区的限制，即使在工业废水中它也能生长，还能为动物提供饲料，净化受污的水资源，为土壤干瘠地区的人们提供更多的可以饮用的水体，是一种经济有效且可行的绿色方法，已成为国内外环境研究领域的热点之．一。1．1浮萍在水体修复中的研究在水生生态系统中，水生植物处在初级生产者的位置，能发挥许多生态功能，如：对水体中N、P、K等营养物质进行短期的储存，对水体中的污染物进行净化，还可以对藻类的生长产生抑制作用以及对水中其他水生生物的代谢有一定的促进作用。浮萍是一种水生的漂浮植物，繁殖速度快，能够富集水体中很多种物质，如氮、磷等营养物质及重金属、有机农药等有毒有害物质。浮萍的应用潜力很强，不仅可以修复富营养化的天然水体，还能处理高氮、磷含量的生活污水和工业废水。浮萍广泛的分布在江河、湖泊等各种水体中，具有非常强的水体修复功能，在水体污染的防治中应用价值很大。用浮萍来修复受污染水体的技术为浮萍修复 重庆大学硕士学位论文技术。1^l浮萍的生理学特征①浮萍的形态特征浮萍是一种显花植物，在植物分类上为单子叶植物纲(monocotyledon)，为泽泻目的一个科。浮萍科是一种单子叶植物纲被子水生植物，草本，无茎或叶，植株dj小型的叶状体组成，叶状体漂浮在水面或者沉入水面下，有根或者无根。根据《中国植物志》(2004)中的记载，浮萍为漂浮或者沉水的小草本植物。它的茎不发育，而以圆形或卵圆形的小叶状体的形式存在，叶状体的长径均不超过lcm；它的叶状体呈现绿色，扁平状，背面强烈的凸起。叶不存在或者退化为细小的膜质鳞片而位于茎的基部。根为丝状，有的无根。浮萍大约拥有4个星期的生命周期，在这期间它至少可以繁殖10-20次；浮萍通常以出芽生殖进行无性繁殖，且繁殖速度较快，很少开花且进行有性生殖，花有l雌蕊，2雄蕊。②浮萍的种类及分布情况浮萍科一共包括浮萍属(Lemna)、紫萍属(Spirodela)、无根萍(微萍)属(Wolfffia)和无根萍(扁无根萍)属(Woffiella)4属。它广泛分布在世界各地，大约一共有40多个种。Bergmann等人(Bergmanneta1．，2000)从全球各地采集了约1000种浮萍，于美国北卡罗来纳州大学的环境生物技术实验室内保存。在我国发现了3属7种浮萍，在长江地区就存在3属5种。③浮萍的生长环境浮萍一般生长繁殖在无风无波的水环境中，在静止或缓流的水面上漂浮生长。它主要生长于池塘、水田、沟渠和湖泊等水体的表面上。浮萍一般在水温25．30℃下繁殖旺盛，因此浮萍通常生长在一些气候温暖的地区，但是由于浮萍对温度有极高的耐受性，在极端的气候条件也可以生存，所以全世界温带和热带区域也均有广泛的分布。在正常气温下，浮萍的内生椭圆形的冬芽在冬季将要死亡之前，会脱离母体沉入到水底，等到翌年春天再浮出水面，在发芽成新株。④浮萍的组成成分浮萍体内的蛋白质和氨基酸含有非常丰富，而且体内淀粉的含量也非常丰富，并含有少量其他化学成分(凌云等1999)如黄酮类化合物质(抗衰老)、胡萝卜素、叶黄素、醋酸钾、氯化钾、脂类化合物以及碘、溴等物质。1．1．2浮萍在水体修复中的去除机理概述浮萍生长的水体中，随着与水面距离的增加，水体中氧含量降低，一般可以分为好氧层、兼氧层和厌氧层，分别对应拥有好氧、兼氧、厌氧的微生物群落。在浮萍水体修复系统中，各种污染物的净化需要依靠浮萍和微生物俩者共同完成。因为浮萍的根系很少，向水中释放的氧气很少；且浮萍生长在水体表面，能妨碍 1绪论空气中的氧气向水体中扩散，所以浮萍塘的好氧层一般都比较浅，约只有在浮萍生长的水面以下lOcm的深度。好氧层下面是兼氧层，再向下则是厌氧层。由于浮萍的根系较小，为微生物提供的附着面积较小，所以浮萍塘内的微生物主要是以悬浮状态存在(A1-Nozailyeta1．，2000)。浮萍塘内主要依靠微生物来降解有机物。研究发现在浮萍塘中尽管好氧微生物群可以降解一些有机物，但厌氧微生物群降解了大部分的有机物(Vermaatetal。，1998)。在浮萍塘中，氮的去除主要有4个过程(种云霄等，2006)。(1)浮萍的吸收富集作用。浮萍可以利于吸收水体中的N、P等营养物质以及重金属离子、农药和其他人工合成有机物等有毒物质，把它们同化为自身结构的组成物质，使其富集、固定在体内，减少水体中污染物的数量。当浮萍收获后，其吸收的污染物质随之转运出水生生态系统，从而达到了净化水体的作用。(2)随固体颗粒物的沉降。当水流缓慢经过浮萍塘时，浮萍的根系会粘附或吸附不溶性胶体和悬浮状颗粒而使其沉淀下来。(3)微生物的降解。在好氧区NH4+-N在硝化细菌作用下发生硝化反应，在厌氧区主要依靠反硝化细菌的作用将有机物降解为氮气并释放到大气中。这样，浮萍根部的污染物就会被微生物分解利用或经生物代谢降解过程而去除。(4)氨的挥发。1．1．3浮萍在水体修复中的特点相比于其它水处理技术而言，浮萍处理系统具有能耗低、效率高、适用性广等优势。浮萍对水体有富氧的作用，微生物群体可以正常的生长，不需要再额外的对污水进行曝气，减少了曝气系统的应用，所以浮萍系统的能耗非常低。其他大型的水生植物收获的时候不仅需要大量人力物力资源，收获以后还要对其进行打碎处理以减小占地体积。与之相比，浮萍只需用网把它们捞起来，然后自然风干即可以了。而且收获后的浮萍还可以作为动物的饲料、堆肥的原料、酒精的原料。由于浮萍对水体中氮磷的吸收速率比较高，所以浮萍系统对氮磷的去除效果也比较高。同时，浮萍对BOD、TSS、重金属也有较好的去除效果。由于浮萍完全覆盖水面，对蚊虫和臭气也有比较良好的抑制效果。浮萍可以处理多种污水，可以在多种气候条件下生活，也可以在多种反应器中生长，所以浮萍系统的适应性比较广，全世界范围内都可以见到浮萍系统的身影，它尤其适合于经济不发达的发展中国家。浮萍治理受污染水体的优势如下：①生长快速浮萍的叶状体能够进行光合作用，是浮萍的主要结构，因此浮萍体内具有较强的新陈代谢活性。在适宜的环境条件下，浮萍生长速率较高。一些研究表明，青萍(Lemnaminor)在温度24℃和光照12h的条件下其生物量4d增加了1倍(Harveyeta1．，1973)。在自然条件下，Reddy等人(1987)的研究结果统计显示，北美地区 重庆大学硕士学位论文浮萍的年干重(DW)生产力为6--26t／a·hm2。Oron等人(1986)也曾经报道，在污水中生长的浮萍相对生长速率可以达到O．10-0．35g／g·d，相当于每2-7d浮萍生物量即可增加一倍。浮萍和其他水生植物生长速率比较见表1．1。表1．1水生植物生长速率Tab．1．1GrowthrateofAquaticplants植物名称生长速率浮萍芦苇金鱼藻水葫芦55t(DW)／ha。yr；生长速率为O．1~o．359／g。d85t(DW)／ha‘yr最高生长速率为0．025gDW／g’d109t(DW)／ha‘)，r②环境适应能力好浮萍可以生长的范围十分广泛，具有较强的环境适应性。在自然条件下，浮萍可以生长的温度范围较大。浮萍可以在5～7℃的低水温(Buddhavaraeta1．，1991：Oroneta1．，1986)和I．-．3℃的低气温(Brixeta1．，1989)环境中可以缓慢的生长。在更低的温度下，浮萍通过冬芽沉到池塘底部，进入休眠状态，直到水温回升后再浮上水面。其最适合的生长温度为23-25℃。当温度达到30℃以上时，浮萍生长开始受到抑制；叶片变黄，生长速率下降。浮萍可以适应的pH的范围也很广泛；例如}浮萍可以在pH为4．5～7．5的水体环境中生存，只有pH大于10时，浮萍的生长才会受到抑制(Zirschkyeta1．，1988)。浮萍对污水中的氨氦(NH4+-hi)、重金属和有机农药等有害物质也都具有较高的耐受性，因此它们能在多种类型的污水环境中生长繁殖(Caicedoeta1．，2003)。污水中的非离子态氨(NH3)对浮萍具有毒害作用，它很容易穿过植物细胞，会造成植物体的新陈代谢发生紊乱。所以，污水中NH3的浓度是影响浮萍耐污能力的关键。研究结果表明，NI-13浓度超过2mg／L时，紫萍会受到毒害作用，而NH4+．N的浓度在高于46mg／L时，浮萍生长开始受到影响(种云霄等，2004)。亚硝态氮(N02‘一N)和硝态氮(N03"-N)浓度对浮萍一般不产生毒害作用。在农村地区的露天粪池中可以见到其表面都生长着浮萍，可见浮萍的耐污能力很强。浮萍在自：然界中拥有较强的竞争能力。原因之一是它具有高的繁殖速率；原因之二是它生长在水体表面，对水面造成覆盖，能够有效的抑制其他的沉水植物和藻类的光合作用。浮萍与其他净化污水的水生植物的环境适应能力(GideonOron，1994；Thomaseat1．，1995)比较详见表1．2。4 1绪论表1．2水生植物对环境的适应能力Tab．1．2EnvironmentaladaptabilityofAquaticplant植物名称适应能力浮萍芦苇金鱼藻水葫芦适应性较强，耐寒，耐污性不如水葫芦，但也能耐受高浓度的污水。不耐寒，但是可以在弱碱性的水体中存活。耐寒对温度感应非常敏感，耐寒性比较弱；耐污能力较强。③氮磷的吸收能力强，氮磷含量高Reddy(1987)等人的研究结果显示，浮萍对氮素的吸收速率为350～1200kg(N)／ha·yr，对磷的吸收速率为116--400kg(P)／ha·yr。研究结果表明，污水中的氮磷浓度会直接影响浮萍对氮磷的转移速率，氮磷的转移速率会随氮磷浓度升高而加快(Tripathieat1．，1991)。也就是说，污水氮磷浓度越高，浮萍的吸收能力随之增强，反之亦然。浮萍体内N、P含量较高，一般高于其他的水生植物，但是生长在不同污染程度水体中的浮萍体内N、P含量会有一些差异。水生植物体内的N、P含量见表1．3。表1．3水生植物体内的N、P含量Tab．1．3NitrogenandphosphorusContentsofhydrophytes④营养成分高印万芬(1998)总结了浮萍与其他用于污水净化的水生植物营养成分比较(见表1．4)。结果显示，浮萍体内粗蛋白和粗脂肪含量较高，而粗纤维则较其他水生植物低。这说明了浮萍不仅营养价值较高，而且容易被家禽消化吸收。还有一些 重庆大学硕士学位论文学者认为浮萍的植物体没有根茎的结构使得浮萍木质素和纤维素的含量仅占干重的2．．7％和10％。浮萍作为含有高营养价值的污水处理植物，引起了世界各国研究人员的关注。PaulSkillicon等人(1993)研究了一些优化浮萍品种的营养成分，其中粗蛋白含量占干重的35％以上，但是粗纤维含量只有干重的5～15％。更有意义的是，浮萍体内蛋白质中的必需氨基酸(EEA)含量比其他植物高，含量甚至接近动物蛋白。此外，浮萍体内的色素和微量元素的含量也比较高。表1．4浮萍与其他水生植物的主要营养成分Tab．1．4Mainnutrientcontentsofduckweedandotheraquaticplants⑤易于收割和利用浮萍是漂浮在水面上生长的一种水生植物，没有根茎结构，所以收割它们非常简单，不需要特殊得工具，也不需要太多得人力，只需要用网把它从水体中捞上来即可。。收获以后的浮萍可以直接喂鱼和家禽，也可以风干以后作为饲料和药材。因此浮萍既易于收割，收割以后又易于处理。浮萍与其他水生植物收获方式和利用情况比较见表1．5。表1．5水生植物收获方式及用途Tab．1．5HarvestingmethodsandUSeSofAquaticplants植物名称收获方式和利用情况浮萍芦苇金鱼藻水葫芦己收获，用网捞出或机械采集。可作为饲料、药材和堆肥，用途较广。采集难，用刀收割，劳动强度大。可以作为造纸原料和建筑材料。难收获。收获以后可用做药材或肥料。难收获，用刀收割。对金属富集高，不可直接作为饲料，可用作堆肥。1．1．4浮萍在污染水体生态修复中的应用与其他许多处理受污染水体的方法相比，浮萍修复技术拥有无法比拟的优点，因此无论是在废水的处理上还是水体的生态修复上，都已经引起了人们的广泛关注。浮萍最早的应用是回收畜牧污水的氮磷营养盐，之后开始逐渐用于处理氧化6 1绪论塘或其他处理系统的出水、化粪池的废水、生活污水、食品和肥料的工业废水及含有重金属或有机农药的工业废水等。一些学者研究了利用浮萍处理稀释的或者人工模拟的养猪废水，研究表明浮萍可以有效去除其中的氮磷。Bergmann等人(2000)用筛选出的优质品种浮萍(Lemnaminor8627)处理稀释50％的养猪废水，结果显示处理效果良好，TKN、NH4+-N、TP和P043"_p的去除率分别达到了83％、100％、49％和31％。Cheng等人(2002)用筛选出的优质浮萍(Spirodelapunctata7776)和(Lemnaminor8627)分别处理人工模拟的养猪废水，研究结果表明，Spirodelapunctata7776对污水中氮的浓度去除速率为0．955mg·L～·h一，对磷的浓度去除速率为0．129mg·L～·h-1，浮萍的产量大约为319．2kgDW·hal-d～；Lemnaminor8627对污水的氮的去除速率为2．11g·m-2．d～，对磷的去除速率为0．59g·m-2．d～，浮萍的产量为290kgDW·haq·d一。Chaiprapat等人(2005)用浮萍(Spirodelapunctata7776)处理人工模拟的养猪废水，研究结果表明其对TN和TP的去除速率分别达到了802．0mg·m-2．d。和214．3mg·m-2．d～，浮萍产量约为18．7gDW·m-2．d～。还有学者对浮萍处理系统处理生活污水做了研究，研究结果显示该系统具有较高的处理效果。Alaerts等人(1996)在室外构建了浮萍处理系统，用于处理生活污水，研究结果显示4年来浮萍系统对COD的去除率可高达90～97％，对KTN和TP的去除率在74～77％范围之间；出水中KTN的浓度可低至2．7mg·L～，TP的浓度可至0．4mg·L一，浮萍产量可达58～1200kgDW-hal·d～。E1．Shafai等人(2007)使用浮萍处理系统处理经过UASB处理后的生活污水，研究结果显示该系统处理效果较好：COD、BOD和TSS的去除率分别可达93％、96％矛n91％，氨氮、TKN和TP的去除率分别可达98％、85％和78％，还可完全去除污水中的大肠杆菌，浮萍产量可达138kgDW·ha～·d一。Hammouda等人(1995)利用浮萍(Lemnagibba)处理经过河水稀释的生活污水，试验结果表明TN和TP的最高去除率分别可达到95．8％和96．2％。Korner等人(1998)用Lemnagibba处理生活污水，结果显示对污水中COD的去除率在74～78％之间。Ozengin和Elmaci等人(2007)研究了用Lemnaminor处理生活污水，结果表明Lemnaminor对污水中的COD、TN和TP的去除率范围分别为73～84％、83～87％幂n70～85％。Sutton和Harold(1977)、VanDerSteen(1999)以及Ran(2004)等人都对浮萍处理生活污水做了研究，结果均显示浮萍系统有良好的净化效果。一些研究还表明浮萍对悬浮物(TSS)的去除具有效果良好，是由于藻类塘出水中含有藻类，所以TSS往往不能达到污水排放标准，而浮萍覆盖水体表面限制了光线穿透水面，可以有效抑制藻类的生长，从而降低了藻类塘出水中的TSS。浮萍还可以用于处理其他处理系统的出水，以降低出水中的氮磷的含量，提升水7 重庆大学硕士学位论文质。Short等人(2007)研究了浮萍对氧化塘出水水质的改善，结果表明了，浮萍改善了氧化塘出水中的TSS、浊度、BOD和氨氮含量，经过浮萍系统处理后出水的透光性约提升了55％。Sutton等人(1975)研究了利用浮萍对生活污水的二级出水进行三级处理，用以去除二级出水中过量的磷，结果如下，浮萍去除了二级出水中97％醮1磷，出水中磷含量降低至2．1mg·L～。在孟加拉，浮萍塘还被广泛应用于处理粪便，然后利用收获的浮萍作为饲料来喂养家禽。Edwards等人(1992)在泰国用化粪池污水作为浮萍培养的营养源，得到浮萍的产量为59kgDW·ha一．d一。1．2浮萍逆境生理响应的研究概述1．2．]【植物逆境生理响应的概述对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。植物在正常的生长发育过程中会产生一定量的活性氧，主要包括超氧自由基(02。)，过氧化氢(H202)等。活性氧的含量会维持在一定的水平上，不会引起膜脂质过氧化反应，从而不危害植物的正常生长。但是植物遭受低温、高光强、重金属和除草剂等逆境胁迫时，细胞内固有的活性氧自由基代谢平衡遭到破坏，促进了活性氧自由基的产生。过量的活性氧自由基会对有机体产生威胁：造成生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化，从而引起细胞损伤：脂氢过氧化物的分解产物也会引发细胞损伤：能干扰植物细胞的光合、呼吸及其他代谢过程，严重时会造成植物细胞死亡。逆境对植物的伤害主要表现在生长缓慢或受阻、细胞脱水、膜系统受到破坏，酶活性受到影响，从而导致细胞代谢紊乱。MDA是植物在逆境和衰老过程中脂质过氧化作用的产物，其含量常用来衡量膜脂质过氧化的程度，还可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一。MDA从细胞膜上产生的位置释放出后，可使纤维分子间的桥键松弛或抑制蛋白质的合成，还可以与蛋白质、核酸反应使其丧失功能，也可导致膜脂质发生过氧化反应，损伤生物的膜结构，使得细胞膜结构和功能上受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。为了免受活性氧的危害，植物体内形成了内源保护系统，该系统包括植物细胞膜的酶保护系统和非酶抗氧化剂(蔡以涝等，1999)。也就是说，当逆境伤害植物时，有些植物在长期的适应过程中形成了各种各样的抵抗或适应逆境，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质、提高保护酶活性等方式来提高细胞对各种逆境的抵抗能力。1．2．2抗逆境代谢关键酶的简介SOD，CAT和POD是防御过氧化系统的重要保护酶，它们都可以有效的清除 1绪论活性氧，减轻脂质过氧化物作用，还可减轻膜的损伤。POD是一种常见的活性较高的一种氧化还原酶，可去除H202，广泛分布于植物的各器官组织中，与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等许多生理代谢过程有关。CAT能催化很多反应，能将H202分解成氧和水，使机体免受毒害作用。而SOD是一种重要的抗氧化酶，它能催化生物体内02"发生歧化反应，把02。转换为H202，H202可被CAT进一步分解或被POD利用。活性氧自由基可对细胞造成的损害，SOD可对抗与阻断这种损害，并及时修复受到损伤细胞，复原细胞的活力。SOD在生物体内的水平高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，意味着衰老与死亡的直观指标，因此SOD对机体的氧化与抗氧化反应平衡起着至关重要的作用。POD、SOD、CAT三者相互协调，可以有效地清除植物体内代谢过程中产生的活性氧，使其在机体体内维持在一个较低的水平上，从而防止了细胞膜脂质过氧化及其它伤害过程的发生。正常情况下，植物体内SOD、POD活性维持在一定水平，使活性氧维持在不至于对植物造成伤害的水平上。当植物遭受到逆境胁迫时，植物体的氧代谢就会失调，活性氧的增加远远超过正常的歧化能力，而清除系统的功能降低，胁迫严重时导致植物死亡。1．2．3逆境对抗氧化防御酶活性的影响在浮萍净化污染物的过程中，浮萍的适应能力较强，其中酶起到了至关重要的作用。浮萍可以处理含有重金属的工业废水，一些学者研究了重金属对浮萍生理的影响。Mohan等人(1997)在有钶和铅存在的情况下研究了浮萍的生理状况。结果表明CAT和蛋白酶的活性大大降低，而POD的活性则明显增高。Mukherjeea等人(2004)研究了重金属对浮萍生长的影响。结果表明，酯酶的变化和环境中重金属的浓度有关。未来的等位酶多态性的研究可以作为一个重要的监测系统用来评估特定污染环境中压力的影响。Xiong等人(2006)研究了铜对白菜的氮代谢和生长的影响，结果表明，铜对氮代谢和白菜的生长有不利影响，表现为铜使白菜根和芽中NR活性降低，总叶绿素减少，降低植物的生物量。Razinger等人(2008)研究了短期镉暴露对浮萍的氧化应激反应。结果表明，CAT和POD活性都受到镉胁迫的抑制作用，CAT活性受抑制较大。关于除草剂对浮萍抗氧化酶系统的影响，也有学者进行了研究。结果表明敌草隆只轻微地诱导了浮萍的抗氧化酶系统中酶的活性(Teisseireeatl．，2000)。抗坏血栓过氧化物酶(APO)的活性没有变化，谷胱甘肽S转移酶(GST)、焦酸过氧化物酶(P．POD)和POD的活性被轻微地诱导，并且保持时间很短。Teisseire等人(2001)还研究了灭菌单的毒害作用，它能提高浮萍的2种H202清除酶和P—POD的活性，对CAT活性的激发非常·t夹(12h后CAT活性就开始增高)，并且效果十分显著，48h9 重庆大学硕士学位论文后同对照相比，CAT的活性达到了252％。Rachel等人(2010)研究了农药的最初浓度对杀虫剂烯酰吗啉的毒性和吸收的影响。结果表明，有机物的毒性或者吸收和最初的农药浓度存在正相关关系，浮萍可以高效的去除有机污染物浓度，并且还可能在天然水体中最终成为植物修复机制。Sellers等人(2004)研究了草胺磷的使用时间对GS活性和氨的积累量。结果显示，经过草胺磷处理后，光照期GS活性快速降低，约下降了80％，并产生NH4+的积累，表明NH，的积累与GS的抑制速度有密切关系。光照也会影响浮萍的生理状况。Farooq等人(2000)对紫外辐射的情况下浮萍的生理反应做了研究。结果表明，在0．4W／cm2、6．84J和8．64J的三种紫外辐射强度下，POD的活性均增高。罗定泽等人(1994)研究了短日照对浮萍体内POD和NR活性的影响。结果显示，对于2个短日照品系中的浮萍，短日照导致POD活性的增高，对日照不敏感的1个品系中的浮萍，POD在短日照下呈起伏和随后的衰减。低温和高温也是逆境环境之一，也会对浮萍生理反应造成一定的影响。黄辉等人(2009)研究了冬季对浮萍放养体系净化养猪场废水的影响。结果表明，在寒冷的冬季采用浮萍混养体系处理养猪场废水效果较好。Song等人(2006)研究了低温(10～12"C)的条件对青萍的生长和保护酶活性的影响。结果显示，青萍生物量的增加基本为零，叶绿素和可溶性蛋白的含量均降低，细胞内保护酶的调节功能发生了紊乱。说明在10～12"C的低温下，青萍己经不具有修复富营养化水体的能力。Artetxe等人(2002)发现了浮萍在低光下生长可以抑制锌和镉的毒性。还有一些学者研究了污水中其他有机物对植物的生理活动的影响。Xu等人(2010)研究了COD对芦苇的生理反应的影响。研究表明高COD值(≥200mgL。)，可以破坏植物的正常代谢。高COD水平(COD≥400mgL。)在芦苇造成明显的生理变化。植物净光合速率明显下降，随着COD的水平。脯氨酸和丙二醛(MDA)含量也大大增加。他们还研究了COD对香蒲的氧化应激反应影响(Xu等，2011)。结果表明，COD含量大于600mgL以时，MDA含量显著增高，SOD和POD活性先上升在下降，而CAT活性呈现下降趋势。1．3植物氮代谢生理响应的研究Nt-h+-N,glN03"-N是植物需要良好氮素的2种来源。植物在吸收和代谢NH4+．N与N03"-N上存在差异。植物体内氮素的转化首先是无机氮转化成低分子量的有机氮如氨基酸、酰胺等，这一过程在高等植物体内是不可逆转的；然后低分子合成大分子的含氮化合物如蛋白质、核酸等；最后是高分子化合物进行酶促水解，再参与植物的各种生理生化过程(MengelandKirkby,1982)。10 1绪论1．3．1氮素同化过程中的关键酶简介NR是一种典型的多中心氧化还原酶，可催化还原N03"-N生成N02--N，是植物氮素代谢中的一个重要的调节酶和限速酶(Cabocheeat1．，1990)。它存在于细胞质中，可利用NAD(P)H为电子供体，在细胞质中催化N03"-N还原成N02"-N。GS是一种控制氮代谢的酶。谷氨酰胺这种氨基酸，不仅被细胞用来合成蛋白质，也是用来运输氮。自由的NH4+对生物有毒性，在细胞中不能太多，但是一些生物过程又会产生游离的NH4+；所以就让谷氨酰胺来运输这些NH4+。当细胞需要运输多余的NH4+的时候，就使谷氨酰胺合成酶催化NH4+和谷氨酸来合成谷氨酰胺，同时消耗ATP。这个反应分成两步进行，在GS作用下先让ATP和谷氨酸反应，生成丫．谷氨酰磷酸；接着NH4+上来，替换掉磷酸(Lameat1．，1996)。GS有GSl和GS2两种同工酶，执行不同的生理功能，分别存在于胞质和叶绿体内。GSl主要是参与根部氮素的同化合成，GS2可以把叶绿体中和光呼吸再合成的NH4+合成为谷氨酰胺(Miflineat1．，1980)，GS2也参与了根部氮素的同化合成(Miflin，1974)。研究还表明光敏素可激活GS2基因的表达。表明其与光有着密切的关系(Edwardseat1．，1989)。在植物氮素代谢中，GS的地位和作用是复杂的。1．3．2氮素对植物氮代谢关键酶的影响植物可以利用的N03-N和NH4+-N对植物氮素代谢酶的活性有不同的影响。在植物氮代谢中，NR是的一种重要的调节酶和限速酶。李彩凤等人(2003)研究了在同一氮素水平下不同的氮形态比例对水培甜菜体内NR的影响。结果表明：随硝态氮比例的增加，叶片中NR活性提高。田霄鸿等人(1999)的研究也发现，在试验水培条件下随硝态氮浓度的增加，莴笋叶片NR的活性增大。很多试验表明，尽管NR为诱导酶，NH4+-N对其活性也有一定的影响。在藻类和真菌中，N出+．N会降低NR活性，从而抑制N03--N的吸收和同化。在高等植物中，NH4+-N对不同种植物体内NR活性的作用不同，有促进作用，也存在抑制作用。Bungard等人(1999)研究了氮素形态对不同植物体内NR活性的影响。结果显示，与NOs-N相比，NH4+-N会显著增加铁线莲叶片中的NR活性，但是在烟草或大麦中没有发现NR活性增加。Sihag研究发现，当NHa+-N和NOa--N共同施入时，7d龄豌豆幼苗叶片的NR活性比单施N03’．N的活性高2倍。结果说明NH4+．N的这种调节作用可能依赖调节蛋白作用，而此蛋白的合成依赖于NH4+．N的存在。但是Claussen等人(1999)的研究发现，与单独供应N03-N相比，单独供应NH4+．N会降低叶片中的NR活性。Mengel等人的研究也指出，以NH4N03为氮素来源的玉米幼苗，NR活性比用N03-N为唯一氮素来源时低，并且NH4+-N为唯一氮素来源时更低。肖凯指出N03’．N或NH4+-N、尿素混合施用时，小麦叶 重庆大学硕士学位论文片的NR活性明显增强，但以单施硝态氮的为最高，单施NH4+．N的为最低。也有人认为，在N03"-N中添加NH4+。N对NR的影响因作物而异。GS催化NH4+-N形成酰胺，酰胺是NH4+-N的解毒形式，也是NH4+-N的储藏形式。NH4+-N对GS的影响因植物耐NH4+-N能力的不同而不同，即随植物耐N地+-N能力的增强，GS活性提高。吴如颂等人(1988)的研究表明，黄瓜叶片的GS活力在NI-14+-N浓度为1mmol／L时最高，5mmol／L时受抑，但水稻在5mmol／LNH4+-N浓度下，其叶片的GS活性反而增加，NH4+-N增加到lOmmol／L时：才出现受抑。郑朝峰(1986)研究发现，N03"-N培养的小麦叶片的GS活力比NI-h+-N培养的高，同时供给N03"-N和NH4+-N时GS活力最高。黄勤妮等(1995)研究了氮素形态对小麦体内GS活性的影响。研究发现，当与N03。-N作唯一氮素来源时，以NH：-N作为唯一氮素来源的小麦幼苗根GS和叶细胞质GS活性较高；当以N03"-N为唯一氮素来源时，完整叶片和离体叶片叶绿体中GS活性增高。Teng等人(2010)还研究了在低浓度氮素中拟南芥的氮代谢表征，结果表明，在氮素缺乏的条件下，以野生型相比，突变型在根和叶中拥有较高的GS活性，它在低浓度氮素下与正常氮素浓度时生长相似。13．3氮素形态对其他酶活性的影响氮素形态还对一些植物其他的酶活性有一定的影响。曹翠玲等人(2003)研究了氮素形态对水培小麦进行生长时体内各种保护酶的影响。结果表明，在NI-14+-N、N03--N混合供应下，叶片中SOD、CAT，根系SOD活性最高；单供N03。-N时叶片POD活性最高；单供NH4+-N时根系POD活性最高。寿森炎等人(2000)研究了高光照强下不同氮形态对番茄生长状况及保护酶活性的影响。试验表明，与供应N03"-N的植株相比，供应NH4+-N的植株生长受到抑制；SOD、抗坏血酸过氧化物酶(AsA．POD)、脱氢抗坏血酸还原酶(DR)、谷胱甘肽还原酶(GR)等保护酶活性均显著较高。朱祝军等(1998)研究了不同氮素形态与光照强度对烟草植株生长和活性氧自由基清除酶活性的影响。结果表明，在高光强时，与供应N03。-N相比，供应NH4+斟的叶中AsA．POD和GR活性明显地升高，而单脱氢抗坏血酸(MDAsA)还原酶活性降低；在弱光强时，与供应N03。-N相比，供应NH4+．N叶片AsA．POD和MDAsA活性明显升高。种云霄等(2003)研究了氮素形态对小浮萍生长的影响。研究表明，在N含量相同的情况下，由于生长受到抑制，生长在N时-N中的小浮萍POD活性高于生长在N03‘-N中的。Wang等人(2008)研究了。NH4+-N对苦草叶中的氧化应激反应影响。研究结果显示氨诱导抗氧化酶的活性，并改变了代谢物的含量，造成叶绿素II的下降；活性氧和过氧化氢水平的增加；进一步组织化学染色表明过氧化氢和POD活性的增加。Wang等(2010)还研究了’氨氮对黑藻属的氧化应激反应的影响。结果显示，在3mmol／L时，黑藻体内的12 1绪论活性氧显著增加，光合色素含量下降，CAT和SOD活性也显著增加。1．4课题研究背景1．4．1课题来源本课题研究受到国家科技重大专项(2009ZX07104．002)和重庆市环境保护局环保科技计划项目(2011第12号)的资助。1．4．2研究目的及意义目前已有研究表明浮萍可用于治理富营养化水体，对氮磷营养盐具有明显去除效果。但就氮素在浮萍处理系统中的迁移、转化的机理以及代谢酶活性与氮去除相互关系的报道鲜见。本试验从植物生理学角度出发，通过对浮萍体内相关代谢酶的提取与活性的测定，跟踪碳、氮代谢过程中关键代谢酶的活性的变化，并将浮萍宏观的生长量和微观的植物代谢酶活性结合起来，了解氮素浓度和形态对浮萍代谢酶的生理学影响。课题对揭示浮萍净化水体的机理及指导其在富营养化水体的修复过程具有重要意义。1．4．3主要研究内容研究内容总共包括三个部分：①NH4+N诱导浮萍氧化应激代谢反应的研究，主要包括：浮萍吸收NH4+．N的动力学特征；NH4十-N浓度对浮萍氮代谢过程中光合色素、SP含量、GS活性的影响；NH4+_N对浮萍抗逆境保护酶SOD、POD活性以及MDA含量的影响。②NH4+-N代谢中浮萍的生理学响应，主要研究：在不同NH4+-N浓度培养液中，随着培养时间的延长浮萍生物量、光合色素、SP含量的响应；考察氮素代谢关键酶GS在NH4+-N代谢过程中的重要作用。③N03"-N代谢中浮萍的生理学响应，主要研究：不同N03--N浓度对浮萍生物量、光合色素、SP含量的影响；氮素关键酶NR和GS活性在N03’-N代谢过程中的作用途径和影响效果。1．4．4技术路线 ——————一里壅奎堂堡主兰垡笙壅 2试验装置、材料与方法2．1试验材料2．1．1植物样品的采集与处理试验所用浮萍均采自重庆大学民主湖。采集的浮萍带回实验室后，首先使用清水清洗去掉杂质，然后筛选出单种浮萍。根据浮萍叶状体的形状和颜色以及根数确定浮萍的种类为Lemnaminor。为了去除附着在浮萍上的细菌、藻类和其他微生物，实验室内使用2％的次氯酸钠溶液冲洗，冲洗5次，最后再用纯水清洗掉浮萍表面带有的次氯酸钠溶液。经过预处理的浮萍用培养液进行放大培养，以便为后续的试验提供纯种的浮萍。(Fredericeat1．，2006；Reinholdeat1．，2006；Songeat1．，2006)2．1．2培养液的选取①放大培养液试验选择改良Hoagland培养液的浮萍培养液，化学成分详见表2．1。表2．1改良的Hoagland培养液成分Tab．2．1ThecompositionofHoagland’SE-medium化学成分培养液浓度(mg／L)MgS04’7H：OCa(N03)2‘4H20KH2P04KN03H3803MnCl2‘4H20ZnS04‘7H20Na2M004‘2H20CuS04’5H20FeCl3’6H20EDTANa2②试验培养液由表可以看出，改良的Hoagland培养液中含有高浓度的Ca、Mg和Fe等金属离子。高浓度的金属离子会影响水中NH4+-N和N03"-N含量的检测，所以必须稀啪一醯一㈨㈣叭呱吣嗽∞ 重庆大学硕士学位论文释原培养以保证水质指标检测的正常和正确。根据预实验结果显示，原培养液在稀释1／10后水中NH4+-N和N03"-N含量的检测能够正常进行。Caicedo等人(2000)试验时，也采用稀释10倍Hutner培养液的方法来消除高浓度金属离子的影响。所以本试验选择1／10改良的Hoagland原液(不加氮素营养盐的培养液)作为所有试验的底液。2．1．3培养条件本试验浮萍培养所涉及的参数包括：温度、光照强度、日照时间以及pH值。根据浮萍培养的相关文献的研究(Oroneat1．，1987；Chengeat1．，2009；沈根祥等，2006；)，本实验浮萍培养的参数范围确定如下：温度23+2oC，光照强度3000+：300lx，光照时间16h，培养液pH值6．5+0．5。2．1．4培养装置浮萍培养装置采用PGX多段光照培养箱(见图2．1)。可以通过调节培养箱的参数来达到试验条件。温度的调节：首先在培养箱中放入一个装有纯水的盆子或者烧杯，测定1、2、3、4、5d的水温，使水温控制在23+20C范围内。光照强度的控制：通过调节培养中灯管开启的个数来控制光照强度，使光照强度在3000+300氏范围内。光照时间的控制：第一时段设置16h，光照强度为4等级，第二时段设置811，无光照。图2．1Fig．2．1 2试验装置、材料与方法2．2仪器设备实验仪器设备见表2．2。表2．2实验仪器一览表2．3分析检测方法2．3．1水质指标测定方法试验所有涉及的水质指标有NH4+-N和N03"-N含量，并根据《水和废水监测分析方法(第四版)》提供的方法进行检测，温度、pH值、光照强度及各水质指标的测定方法见表。表2．3水质分析方法Tab．2．3Waterqualityanalyses指标分析方法温度pH光照强度N03"-NNH4+-N水银温度计测量电极法Test0545照度计紫外分光光度法纳氏试剂分光光度法2．3．2浮萍鲜重的称量浮萍鲜重(FreshWeight，FW)并没有规范统一的测定方法。本试验参考相关文17 重庆大学硕士学位论文献中采用的测定方法(Bergmanncat1．，2000；Reinholdcat1．，2006)，并对其进行了改进。改进后的方法如下：用滤网将需要测定鲜重的浮萍从水中捞起，自由滤水5min，然后将浮萍平铺放置在垫有吸水纸的滤纸上，吸水5min，最后立即用电子天平称其重量，鲜重需精确到0．0lg。2．3．3浮萍体内叶绿素测定方法取新鲜浮萍样品0．19FW，放入已预冷的瓷研钵中，加入少量2-3ml95％乙醇迅速研磨成浆，然后将均浆液移入刻度离心管中，再加入3--4ml95％乙醇清洗研钵并将其也移入刻度离心管中，充分摇晃后，放入冰箱中避光提取18～24小时。提取后的离心管置于冷冻离心机上，在4"C条件下以3500转／分(r．min‘1)离心10min。然后用乙醇定容至10ml，用1cm比色皿，以95％乙醇为空白，在665，649，470nm下的吸光度值(OD)。计算公式如下：P．i-绿素a浓度=13．950D665—6．880D649(2．1)JD6叶绿索b浓度=24．960D649—7．320D66s(2．2)JD胡萝卜素浓度=(10000D470一2．05p口一114．8Pb)／245(2．3)光合色素含量(pgg-IFw)=鱼茎鳖鏖型笔翼篓薹掣(2．4)2．3．4浮萍体内SP的测定方法称取浮萍0．2：gFW左右放入已预冷的研钵中，加O．05mol／L磷酸缓冲液(pH=7．4)6ml冰浴条件下研磨成匀浆，在4"C15000r．mind条件下离心15min，取其上清液稀释到10ml即酶的粗提液(2％组织匀浆)。用移液器吸取0．05ml酶的粗提液于10ml比色管中，立即加入3ml考马斯亮蓝溶液，混匀静置10min后，使用lcm比色皿在595nrn处，用蒸馏水调零，测定各管的OD值。本实验采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定SP含量，测定原理、药品配制和操作说明详见说明书。计算公式如下：鼬糊，mggqFW)=堕斋慕等鬻学亿5，2．3．5浮萍体内NR活性的测定NR可催化植物体内的N03"．N还原为N02"-N。产生的N02"-N与显色剂反应生成红色化合物，在540nm处比色测定。将诱导剂应用液倒入烧杯中备用。取19左右浮萍鲜重放入诱导剂应用液中，浸泡诱导2小时后，取出己诱导过的样本，置于．．20℃冷冻30min，然后用滤纸吸干并称重。按重量体积比(WN)加入9倍体积的匀浆介质，冰浴下研磨成匀浆，制成10％的匀浆液，4000r．min。1离心10min，取上清液待测。根据NR试剂盒说明书的操作步骤进行操作完成后，在4。C350018 2试验装置、材料与方法r．mino离心10min，取上清液在lcm比色皿，540nm处进行比色，用蒸馏水调零，测定各管OD值。本实验采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行NR活性的测定，测定原理、药品配制和操作说明详见说明书。计算公式如下：样品中酶活力(gmolN02。mg。1FWmin。1)=(测定OD一对照OD)x标准管浓度×样本取样量×样本测定前稀释倍数，，、，、(标准0D一空白OD)x样本鲜重×时间P～72．3．6浮萍体内GS活性的测定在GS的作用下，谷氨酰胺和羟胺反应生成r谷氨酰氧肟酸和氨，并通过显色反应可测定谷氨酰氧肟酸的含量。取1．6ml反应混合液B，加入0．7ml粗酶液和0．7mlATP溶液，混匀，在37。C下水浴加热30min，之后再加入lml显色剂显色，摇匀放置片刻后，4。C条件下于50009下离心10min，取上清液在540nm处测定OD值，并以加入反应混合液A作为对照。计算公式如下：GS活力(gmolmg_proth-1)=测定OD，，、．、蛋白含量×反应时间×反应中加入粗酶液的体积P“72．3．7浮萍体内POD活性的测定POD催化H202反应的原理，通过测定420nm处吸光度的变化得出其活性。该酶的粗提液同蛋白含量测定时的提取方法相同。根据POD试剂盒说明书的操作步骤进行操作后，在4℃3500r．min。1下离心10min，取其上清液于420nm处，使用lcm比色皿，双蒸水调零，测定各管OD值。本实验采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行POD活性的测定，测定原理、药品配制和操作说明详见说明书。计算公式如下：POD活力(ggmg叫protmin。1)=(测定管OD-对照管OD)×反应液体积x1000，，、。、12x取用量体积×反应时间×蛋白浓度卜～72．3．8浮萍体内SOD活性的测定黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶系统会产生超氧阴离子自由基(02。)，后者可把羟胺氧化形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色。该酶的粗提液同蛋白含量测定时的提取方法相同。根据SOD试剂盒说明书的操作步骤进行操作后，室温放置10min后，于550nm处，使用lcm比色皿，用蒸馏水调零，测定各管OD值。本实验采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行SOD活性的测定，测定原理、药品配制和操作说明详见说明书。计算公式如下： 重庆大学硕士学位论文s。。活力cktgmg'lprotminl，=罴裟蔫黧徽亿9，2．3．．9浮萍体内MDA含量的测定脂质过氧化的降解产物中包括MDA，它可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合形成红色产物。lVIDA的粗提液同蛋白含量测定时的提取方法相同。根据MDA试剂盒说明书的操作步骤进行操作混匀后，离心管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一个d,FL，95‘0水浴40min，取出后流水冷却，然后在3500--4000r．min一下，离心10min。取其上清液，使用1cm比色皿，在532nm处，蒸馏水调零，测定各管的OD值。本实验采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行MDA含量的测定，测定原理、药品配制和操作说明详见说明书。计算公式如下：，讧。A含jt(nm。·m百1prot，=号辈喜薹等等兰赛翥萋薹蓍是完黼c2．·。，2．4试验)号法2．4．1浮萍对NHa+-N的吸收动力学试验为了探索高浓度NH4+-N对浮萍是否有毒害作用，同时结合富营养化水体中的浓度水平，设定NH4+-N浓度上限为56mg·L～(4mmol·Ld)，NI-14+-N浓度的梯度设计为0．5、1、3、5、7、lO、14、28、42、56mg·L～。浮萍在含有不同NH4+-N浓度的1／10Hoagland培养液中培养14d之后再开始试验。通过试验前后培养液中的NH4+-N浓度差与试验时间直接求出吸收速率。在1000ml烧杯中加入200ml含有不同NH4+-N浓度的培养液，调节pH值为6．0，再放入19或29鲜重的浮萍，用封口膜封住烧杯口，然后把烧杯放入培养箱中培养8h，每个浓度设置3个平行。根据培养液体积和浮萍鲜重求出浮萍对该N地+-N浓度的单位吸收速率，做出吸收速率与NH4+-N浓度的关系图，然后对数据进行M．h嗄方程的回归拟合。M．M方程是表示酶促动力学方程，表明了底物浓度与酶反应速度间的定量关系，也可以用于描述浓度与去除速率(吸收速率)之间关系。本试验的M．M回归方程如下：y=％。毒(0．11)式中：x—NH4+-N浓度，mg·L～；y一浮萍对NH4+-N的吸收速率，mg·g-I"h"1；‰一一浮萍对NIl4+-N的极限吸收速率，mg·g-i．h～；k一亲和力常数，h-I；2．龟2ⅫH4+．N对浮萍氧化应激反应的影响为了研究NH4+-N对浮萍的生理状况的影响，本试验跟踪监测了浮萍主要代谢20 2试验装置、材料与方法途径相关代谢酶的活动，及时考察了解在不同NH4+-N浓度下浮萍生理状况的变化。培养液使用1／10Hoagland培养液，选择NH4+-N浓度上限设置为4mmol’L～，NH4+-N浓度的梯度设计为0．5、1、2、3、4mmol·L一。浮萍在含有不同NH4+-N浓度的1／10Hoagland培养液中开始培养。每2天更换培养液一次，并调节pH值为6．0。当浮萍培养1、3、5、9、14d的时候，分别取出一定量的浮萍用于测定浮萍体内叶绿素含量、SP含量jPOD活性、SOD活性、MDA含量和GS活性，观察这些指标的变化趋势。2．4．3浮萍对不同营养水平形态氮的吸收富集浮萍在含有不同形态氮素(NHa+-N和N03--N)的培养液中培养14d后开始试验，通过时间依赖试验和浓度依赖试验分别考察在不同NH4+-N和N03。-N浓度的水体中浮萍的生理状况及对营养盐的去除。培养液使用1／10Hoagland培养液，选择氮素浓度上限设置为3retool’L-1，NH4+-N和N03"-N浓度的梯度设计为0．5、1、2、3mmol·L-1。在1000ml烧杯中分别加入200ml含有不同形态氮素的培养液，调节pH值为6．0，再放入lg左右鲜重的浮萍，用封口膜封住烧杯VI。低浓度(0．5、lmmol‘L以)在试验的第0d、0．25d、0．25d、ld、2d、3d时进行各指标的测定，而高浓度(2、3mm01．L．1)在试验的0d、ld、2d、3d、4d、5d时进行各指标的测定。测定的指标包括浮萍鲜重的称量、水体中NH4+．N和N03"-N的测定以及浮萍体内叶绿素含量、SP含量、NR活性和GS活性的测定。 ～————————————重量塑主堂垡笙垄 3NH4+-N对浮萍氧化应激代谢反应的影响N出+．N对浮萍氧化应激代谢反应的影响NH4+-N是水体中重要的氮素形态之一。虽然NH4+-N可被植物直接利用，但高浓度的NH3和NH4+．N有可能会对植物机体产生毒害作用。有关研究表明，NH4+很容易通过扩散穿过细胞膜，防碍形成质子驱动势，诱导氧化磷酸化和光合磷酸化解偶联，破坏细胞膜的结构，从而抑常lj-_2-氧化碳暗固定过程，影响光合作用的效率，引发植物体内出现代谢失调现象(张福锁等，1995)。不过，植物对环境中的NH4+-N有一定的调节能力。有研究发现高浓度NH4+-N处理下，把NH4+从细胞内运出要耗费的能量较大，植物耗氧量增加40％左右(Beste，1980)。植物还可通过GS和GOGAT的作用，把NH4+-N转化成为谷氨酰胺或者谷氨酸。GS对NH4+_N的亲和能力很高，保证了叶绿体中的NH4+-N维持在较低的水平，从而避免了NH4+．N的累积而引起的光合磷酸化解偶联。NH4+-N会导致浮萍体内产生大量的活性氧(Becketa1．，1991；Gerendaseta1．，1997)，因此可以通过测定植物体内POD、SOD活性来判断NH4+-N的毒害作用。有关NH4+．N对浮萍的毒害作用尚无定论。研究学者发现许多浮萍科的植物不能耐受水体中高浓度的NH4+-N(Wang，1991；Clementeatl．，1993)，Caicedo等人(2003)还指出NH4+-N的毒害作用是由NH3和NH4+共同引起的。但是沈根祥等人(2006)的研究表明随着溶液中NH4+-N浓度的增加，浮萍对氨氮的吸收速率也不断增大，达到一定程度后趋于饱和状态。为了研究NH4+-N对浮萍的影响，及时了解浮萍体内生理状况，本试验考察了随着浮萍接触NH4+．N时间的增加，其体内主要代谢途径中光合色素、SP含量以及各种关键酶活性的变化。3．1浮萍对NH4+-N吸收动力学的研究3．1．1浮萍对不同浓度NH4+-N的吸收速率在浮萍净化系统中，氨氮的去除途径主要包括硝化反硝化、挥发和吸收。通过测定，浮萍覆盖的培养液中DO值一般不小于4mg·L～，因此在培养液中不利于反硝化反应；试验使用的浮萍经过消毒作用去除微生物，使用烧杯均用封口膜封住杯口，并且在盆壁和浮萍的根部也未观察到有生物膜的生成，所以可以忽略硝化反硝化反应以及微生物的吸收对NH4+-N去除造成的影响。根据前期试验各浓度Nm+-N的挥发量随时间的关系试验的结果，在一天时间内NH4+-N浓度减小了0．05％，所以试验可以忽略NH4+．N挥发造成NH4+．N浓度降低的影响。综合以上分析，可以认为在本试验中浮萍的吸收作用是NH4+-N浓度降低最主要的原因。根据培养液体积、浮萍鲜重(FW)以及NH4+-N的浓度去除速率求出单位鲜重浮23 重庆大学硕士学位论文萍在各浓度下的NI-h+．N吸收速率见表3．1。从表3．1中可以看出，浮萍对氨氮的吸收速率随NH4+-hl浓度增加而增大，当NH4+-N浓度大于7mg·L。1以后，浮萍的比吸收速率变化不大。表3．1浮萍对不同浓度NH4+-N的吸收速率Tab．3．1neuptakevelocitytodifferentNH4+-Nconcentration3．1．2浮萍对NH4+-N的吸收特征试验结果表明，浮萍对NH4+-N的吸收速率随着其浓度的增加而不断增大，并逐渐趋于饱和。图3．1是对NH4+-N浓度和浮萍对NH4+-N吸收速率进行M．M方程拟合，得到回归方程为y=O．0733x／(1．4409+x)，回归系数R2=O．913(n=10)，说明浮萍吸收速率对NH4+-N浓度的M．M方程拟合程度较好。通过回归方程得出浮萍对N出+-N的最大吸收速率为0．0733mg·g～FW·h．1，浮萍对NH4+-N的亲和力常数为1,4409。本研究与浙江大学沈根祥等人的研究结果有类似的趋势。他们研究了在7、14、28、42、56、70、84mg·L“浓度下浮萍(Spirodelaoligorrhiza)对NH4+-N的吸收速率，结果显示浮萍对NH4+-N吸收速率与NH4+-N浓度拟合得到的M．M方程为y=O．100·x／(5．890+x)，r2=0．98(n=7)，拟合程度较好最大吸收速率为0．100mg-g“1FW·h．1，浮萍对NH4+．N的亲和力常数为k=5．890。说明高浓度NH4+-N对浮萍的吸收速率影响不显著。24 3NH4+-N对浮萍氧化应激代谢反应的影响，-工≥争。如如g苫毫。嵩&aAmmoniaconcentration(mg·L-11图3．1浮萍对不同浓度NH4+-N的吸收动力学曲线Fig．3．1TheabsorbingcharacterofduckweedtodifferentNH4+-Nconcentration3．2浮萍对不同浓度NH4+-N的氮代谢响应3．2．1浮萍叶绿素和蛋白含量植物光合作用需要大量的氮素，用于合成光反应的色素蛋白质以及光合作用碳同化过程相关的蛋白质。浮萍在培养液中经过培养14天后，不同NH4+．N浓度对浮萍光合色素的影响如图3．2所示，NH4+-N处理组的浮萍体内光合色素的含量要高于对照组的含量；随着NH4+-N浓度的增加，胡萝卜素的含量基本不变，始终保持在一个较低的水平；浮萍体内总叶绿素含量(包括叶绿素a和叶绿素b)、叶绿素a和叶绿素b的含量呈现先升高后降低的趋势。经过单因素方差分析得出处理组之间光合色素含量变化不显著(P>0．05)。因此，NH4+．N浓度的改变对浮萍体内光合色素的合成影响不大。试验过程中NH4+-N浓度为4mmol／L的处理组，浮萍的新生叶状体表现出轻微的失绿变白症状，叶绿素的测定结果也在此时降低，这说明了当NH4+-N浓度为4mmol／L时，使浮萍体内发生光合磷酸化解偶联，破坏了叶绿体的结构，从而使得叶绿素含量下降。叶绿素含量是衡量叶片衰老和植物光合器官生理状况的重要指标，其含量在一定程度上反映了植物同化物质的能力(Yangcat1．，1995)。本试验结果表明当水体中NH4+-N浓度的改变对浮萍体内光合色素的合成影响不大；当NH4+-N浓度大于4mmol／L时会对妨碍植物体内的叶绿素合成，抑制浮萍体内的光合作用，降低了浮萍同化物质的能力，但是影响不是很严重。 重庆大学硕士学位论文IlThetotaIchloroohvllFf厂4ChloroohvlIa’J一壬≤一-j～。≥—r_’P●'-壬秀二羹至三萋三雾三雾萋壬=雾壬丙壬季'rf萋三雾=壬萋蝈羹王=雾=：00．5123NH4*一Nconcentration(mmol／t．)J图3．2不同NH4+-N浓度处理下浮萍体内光合色素的含量变化Fig．3．2ChangesofphotosyntheticpigmentcontentswithdifferentNH4+-Nconcentration蛋白质含量的变化显示了植物细胞活性的变化。NH4+-N在植物体内被同化为氨基酸或者直接掺入而形成酰胺，然后进一步被合成为蛋白质等物质。由于氮素是蛋白质的基本组成元素，NH4+-N浓度的高低在一定程度上影响sP的含量。随着培养时间延长各NH4+-N浓度下浮萍SP含量的变化如图3．3所示，对照组的浮萍SP含量随着时间的延长呈下降趋势：NH4+-N处理组的浮萍体内SP含量呈现先上升后又下降的单峰变化趋势，在试验后期浮萍体内SP含量基本达到稳定。第3d时各NH4+-N浓度处理组的浮萍体内SP含量达到最大，此时浮萍的叶状体出现轻微萎蔫现象。分析原因可能因为试验开始初期，浮萍细胞内NH4+．N浓度低于培养液中NH4+-N的浓度，使得浮萍的细胞发生脱水现象(陈晓，2006)，从而引起了浮萍体内单位质量SP含量的升高。NH4+-N可以通过快速扩散的方式进入浮萍细胞膜，并在细胞内进行一系列的反应后使得浮萍细胞内外NH4+．N浓度达到平衡。在第5天时，浮萍叶状体恢复正常，使得浮萍体内单位质量SP含量下降。浮萍在培养液中培养14d后，各NH4+．N处理组的浮萍体内SP含量基本达到稳定，NH4+-N处理组的SP含量远远高于对照组。随着NH4+-N浓度的增加，浮萍体内SP含量增加，在3mmol／L处浮萍体内SP含量达到最高值，是0．5mmol／LNH4+．N培养液中的1．16倍。而当NH4+-N浓度大于3mmol／L时，SP含量却表现下降的趋势，这是因为植物体内含有一定的游离氨，氮代谢较多停留在酰胺的阶段，不能进一步合成SP或者合成SP的量减少，造成浮萍蛋白含量降低，影响了26吾；渤{寻哪瞄蕊{i耋鼬抽伽懈∞爹u2—x一叫IJ啦叫c^vop!o仨帕一—口．{qo书c∞D=xc口oJo—co．∞=xc△—。Jo—cQ．=xc△oJo—co一再芑-ou上 3NH4+-N对浮萍氧化应激代谢反应的影响浮萍正常的生理活动。SP含量可以在一定程度上代表植物吸收环境中的氮营养的能力，即利用氮素合成自身蛋白质的能力。本试验结果表明，当NI-h+-N浓度为3mmol／L时很容易收获SP含量较高的浮萍，提高了后期饲养化浮萍的利用价值：当NH4+-N浓度大于3mmol／L时，SP的合成过程受到了抑制。Time(d)图3．3不同浓度NH4+-N处理下浮萍的SP的含量变化Fig．3．3ChangesofSPcontentswithdifferentNH4+-Nconcent，ration3．2．2浮萍体内氮代谢酶活性的变化NR是一种诱导酶，且它只有在N03--N溶液中经过一段时间的诱导后才能逐步的形成，所以当水体环境中没有N03"-N存在时，NR活性很低。虽然NH4+-N的存在也会抑制硝酸还原酶的活力，但是根据前期试验发现，在给定NH4+-N作为单一氮素来源的培养液中，各NH4+-N浓度处理组的浮萍体内NR活性在检测线附近。因此，在该试验过程中未考察NR活性的变化。从图3．4中可以看出，随着浮萍培养时间的延长，各NH4+-N处理组的浮萍体内GS活性都表现出先下降后上升的趋势，在第3d达到最低值。这是由于在第3d时，浮萍细胞脱水影响了浮萍的生理活动，在此表现为浮萍体内GS活性下降。浮萍在NH4+-N培养液中培养5d以后，各NH4+-N处理组的浮萍体内GS随着培养时间的增加基本达到稳定，即浮萍的驯化过程14d即可完成。在试验结束时(第14d)，各NH4+-N处理组浮萍的GS的活性随着NH4+-N浓度的增加呈现逐渐增加的趋势，但当NH4+-N浓度达到2mmol／L后浮萍体内的GS活性将不再增加或者增加不大。这可能是因为当NH4+-N浓度大于2mmol／L时，27 重庆大学硕士学位论文植物体内含有一定的游离氨，氮代谢较多停留在酰胺的阶段，不能进一步合成蛋白质，进而影响了GS活性(颜吕宙等，2007)。GS是处于氮代谢过程的关键酶，参与多种氮代谢的调节。试验表明，低NH4+-N浓度促进GS活性的提高，促进氨基酸的合成和转化，高NH4+-N浓度对GS活性的影响不大。图3．4不同NH4+-N浓度处理下浮萍体内的GS活性变化Rg．3．4ChangesofGSactivitywithdifferentNH4+-Nconcentration3．3浮萍对不同浓度NH4+-N的逆境响应3．3．1浮萍体内抗氧化酶的变化趋势在生物体内SOD的水平高低间接反映了机体清除活性氧自由基的能力，意味着衰老与死亡的直观指标，因此SOD对机体的氧化与抗氧化反应平衡起着至关重要的作用。由图3．5可见，随着浮萍培养时间的增加，浮萍体内SOD活性呈现先降低后增加最后基本达到稳定的趋势，在第3d取得最小时。这是因为在NH4+．N培养液中培养浮萍的初期，浮萍细胞脱水影响了SOD活性，使SOD活性降低，过量02。在浮萍体内积累。当02"积累到一定程度时，刺激SOD活性使其活性在第5d升高，浮萍体内的02’在SOD的作用下分解成H202和02。培养5d以后，浮萍体内SOD活性变化稳定，说明此时浮萍能够稳定去除02‘使浮萍免受毒害作用。在第14d试验结束时，随着培养液中NH4+-N浓度的增加，浮萍体内SOD活性呈现先减少后增加的趋势，在NH4+-N浓度为3mmol／L时浮萍的SOD活性取得最小值。一般情况下，SOD活性大小代表浮萍体内产生02"的多少。产生02‘的量越多SOD活性越高。试验结果说明在NH4+-N浓度为3mmol／L时，浮萍体内形成^．．1I．-uⅧ譬9ld．h暑一o__ITIv∞o 的02‘较少，SOD活性较低，此时浮萍生长最优。图3．5不同浓度NH4+．N处理下浮萍体内的SOD活性变化Fig．3．5ChangesofSODactiVitywithdifferentNH4+-Nconcentrati。nTime(d)图3．6不同浓度NH4+-N培养液处理下浮萍体内的POD活性变化Fig．3．6ChangeSCIfPODactiVitywithdifferentNH4+-Nconcentration由图3．6可知，随着浮萍在NH4+-N溶液中培养时间的延长，名-NH4+-N处理组浮萍体内的POD活性呈现先升高后下降的趋势，在第9d各试验组浮萍体内的POD活性均达到最大值。这是因为，在浮萍培养3d以后，SOD活性增强(图3·5)，29^，暑暑．．m譬量k昌∞3扫IA口2Qo∞^暑lII．II【010Jd．∞暑曲3置苫召譬Qod 重庆大学硕士学位论文SOD催化02‘生成了更多的H202，使浮萍体内H202含量增加了。当H202积累到一定程度后会激发POD活性的突增来消除H202。在第9d后，萍体内POD活性下降，这是因为浮萍体内POD清除了大部分H202，、使H202含量下降，POD活性也随之降低。当试验进行14d时，随着培养液中NH4+-N浓度的增加，浮萍体内POD活性呈现先增加后减少的趋势，在NH4+．N浓度为3mmol／L时浮萍体内的POD活性达到峰值，NI-h+-N浓度为4mmol／L的处理组浮萍体内POD活性均低于其他NI-h+．N浓度处理组。POD活性大小代表去除H202的能力即POD活性越小，去除H202的能力越小。试验结果表明浮萍可以耐受3mmol／L的NH4+-N浓度，高于4mmol／LNI-14+-N浓度会影响浮萍正常的生理活动。3．3．2浮萍体内MDA含量的变化趋势MDA含量的大小间接反应了机体细胞受活性氧自由基的攻击程度。由图3．7可见，随着浮萍培养时间的增加，浮萍体内MDA含量呈现先升高后下降的趋势，并在第5d时达到最大值。这说明浮萍在第5d时浮萍细胞内受到胁迫的程度最大。5d以后MDA含量下降，是因为浮萍细胞为保护自己免受危害激活了防御过氧化系统，通过各种保护酶POD、SOD的作用，降低了MDA的含量。由此可见，生长在含有NH4+-N培养液中的浮萍有一段不适应期，在不适应期内浮萍体内膜系统被氧化而受到损伤，浮萍MDA含量上升，随着浮萍对含NH4+-N培养液的逐渐适应以及相应防御系统的启动，膜系统又逐渐被修复，使得浮萍MDA含量下降。图3．7不同浓度NH4+-N处理下浮萍体内的MDA含量变化Fig．3．7ChangesofMDAcontentwithdifferentNH4+-Nconcentration^荟盆口So量_量舌o《Q乏 3NH4+-N对浮萍氧化应激代谢反应的影响在第14d试验结束时，MDA的含量随着NH4+-N浓度的升高呈现先下降后升高的趋势，并在NH4+悄浓度为3mmol／L时达到最低值。在低NH4+-N培养时的浮萍MDA含量与3mmol／L时差异不显著；在NH4+-N浓度为4mmol／L时MDA含量却显著增加，且远远高于其他NH4+_N处理组。这是因为4mmol／LNH4十-N浓度下浮萍体内活性氧自由基积累较多，抗氧化酶保护系统和非酶自由基清除系统不能及时清除掉过量的超氧自由基，从而导致了脂质过氧化产物MDA的升高。试验结果表明，浮萍可以在3mmol／L的NH4+N浓度中生长状况最优，而高于3mmol／LNH4+-N对浮萍细胞带来的损伤较大。SOD活性的变化趋势与MDA含量的变化趋势一致，因此SOD活性的大小可以用于指示浮萍受到高浓度NH4+．N胁迫的程度。3．4小结①M．M方程可以描述浮萍对NH4+．N的吸收速率和NHa+-N浓度之间的关系，回归方程式为y=O．0733x／(1．4409+x)，回归系数R2=O．913(n_10)，达到极显著水平(p<0．01)，通过回归方程得出浮萍对NH4+-N的最大吸收速率为0．0733mg·g‘1FW·h．1，亲和力常数为1．4409h．‘。②培养液中NH4+-N的浓度对浮萍的生长状况有一定的影响。随着NH4+．N浓度的增大，浮萍体内SP、叶绿素和POD活性呈现先增大后减少的趋势，并在NH4+一N浓度为3mmol／L时达到峰值。浮萍体内SOD和MDA含量随着NH4+-N浓度的增加先降低再升高，并在NH4+-N浓度为3mmol／L时达到最低值。结果表明浮萍在O．5～3mmol／LNH4+-N浓度范围都能正常生长，但是当NH4+．N浓度大于3mmol／L时，浮萍虽然从表观上仍能正常生长，但酶学指标说明NH4+-N浓度大于3mmol／L时对浮萍产生了胁迫。 ——————一重鏖奎堂堡主兰垡笙塞32 4NH4+-N代谢中浮萍的生理学响应NH4+-N的吸收是一种逆电化学势进行的主动吸收过程，并且能被代谢抑制所阻断。根据相关研究，NH4+-N是浮萍优先吸收的一种氮源，这是因为NH4+-N被吸收后可以直接用于合成蛋白质，而NOs-N吸收后则需要在体内进行N价态的转化才能用于蛋白质的合成(Poratheat1．，1982)。NI-h+．N进入植物细胞后，必须尽快与有机酸结合，形成氨基酸或酰胺。NH3和NH4+-N之间有一个转换，NH4十-N去质子化会形成NH3，NH3通过快速扩散穿过细胞膜，对植物毒害作用较大(Marsehnercatl．)。植物对NH4+-N的吸收机理，目前尚无定论。NI--h+_N拥有2条同化途径见图4．1。最普通和重要的途径是GS／GOGAT途径，即NH4+-N在GS的作用下经过GS／GOGAT循环生成各种有机氮。另外一个重要的NH4+．N同化途径是NH4+．N还可直接与植物呼吸作用产生的q．酮酸结合生成氨基酸。在细胞中NH4+-N可首先与0L．酮戊二酸直接结合生成0【．亚氨基谷氨酸，然后当还原辅酶(NADH2)存在的情况时，在谷氨酸脱氢酶(GDH)作用下形成谷氨酸。这一反应是可逆反应，主要在线粒体中进行，并且线粒体提供反应所需的NADH2和a一酮戊二酸。这俩种途径生成的低分子含氮化合物在转氨基作用下合成大分子的含氮化合物如蛋白质、核酸等，大分子化合物进行酶促水解，再参与植物的各种生理生化过程。∥昝黻、厂馘酊、、，棚辫黯眠条黜矽℃谷鲻奠；镰嚣躐甥图4．1NH4+-N的同化途径在本章中选用浮萍为试验对象，设置不同初始NH4+-N浓度，通过定期测定培养液中的NH4+-N浓度、浮萍鲜重、叶绿素、SP含量及体内GS活性的变化情况，试图了解不同NH4+-N浓度的营养条件下，随着培养时间的变化浮萍的生长情况及氮素关键酶GS在NH4+-N代谢中的作用。 重庆大学硕士学位论文4．1NH4+-N代谢中浮萍生物量、光合色素及SP含量的变化4．1．I培养液中NH4+-N．浓度和浮萍的生物量的变化趋势(A)11me(d)Time(d)图4．2，不同NH4+-N浓度下培养液中NH4+-N浓度和浮萍的生物量的变化Fig．4．2ChangesofbiomassandNH4+-NconcentrationwithdifferentconcentrationsofNH4+-N浮萍可以耐受污水中的高浓度的NH4+-N。图4．2描述了不同NH4+-N浓度下培养液中NH4+．．N浓度和浮萍生物量随着培养时间的变化。从图中可以看出，各NH4'‘-N处理组培养液中的NH4+-N浓度随着浮萍处理时间的延长呈现下降趋势，^口邑田田∞EoI∞3^II土l—col重．1c∞ocoDz．．，工z—oE一∞∞母Eo!日一1，Dl卫Jvco；嵋量c∞ocooz．．．工z 4NH4+-N代谢中浮萍的生理学响应浮萍的生物量随着培养时间的增加呈上升趋势。这是因为浮萍可以吸收利用培养液中的NH4+一N，用于合成自身生长的物质，导致了浮萍生物量的增加。NH4+．N浓度变化曲线中处理初期的斜率大于处理后期，并且随着NH4+．N初始浓度逐渐增大，浮萍对NH4+．N的初始吸收速率呈现增大趋势。这与表4．1中浮萍的增长速率的变化趋势一致。由表4．1可知，各不同N乩+-N浓度处理组浮萍的增长速率随着处理时间先增加后降低，各NH4+-N处理组浮萍增长速率分别在0．5、1、2、3d时达到峰值，最大值分别为0．209、O．352、0．382、0．4329·d～。这是因为试验初期培养液中NH4+-N浓度富足，浮萍可以同化NH4+-N的数量增加，浮萍合成自身生长需要的物质增加，因此培养液中NH4+-N浓度降低迅速，浮萍生物量增长速度较快；当培养液中NH4+-N含量匮乏时，浮萍没有充足的氮源，对NH4+-N的吸收速率下降，浮萍的增长速率也随之下降。从表4．1还可以看出，随着培养液中NH4+-N初始浓度的增加，浮萍的初始增加速率呈现增加的趋势，并趋于稳定，2．0mmol／L和3．0mmol／L处理组浮萍的初始增长速率几乎相同。这是因为高浓度NH4+-N处理下，浮萍机体内会积累大量活性氧，此时浮萍体内会产生应急防御系统来降低活性氧对植物体的毒害作用，导致高浓度下浮萍增长速率增加不显著。试验结果表明，在高的NH4+_N浓度下浮萍的生长表现出一定的抑制作用，但是该影响并不明显，浮萍的生物量依然在增加。表4．1不同NH4+-N浓度下的浮萍的增长速率变化Tab．4．1ChangesofGrowthratewithdifferentconcentrationsofNH[4+-N4．1．2不同NH4+-N浓度对浮萍体内光合色素和SP含量的影响 重庆大学硕士学位论文-fime(d)OTime(d)(总叶绿素：圆形；叶绿素a：菱形；叶绿素b：正三角形；胡萝卜素：倒三角形)图4．3不同NH4+-N浓度下浮萍体内光合色素含量的变化Fig．4．3ChangesofphotosyntheticpigmentcontentwithdifferentNH4+-Nconcentrations光合色素的含量在一定程度上反映了植物同化氮素的能力。图4．3描述了不同NH4+．N浓度下浮萍体内各种光合色素随着培养时间的变化。由图可知，浮萍体内总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素的含量随着培养时间的延长变化趋势基本一致，均呈现先上升后下降的趋势。通过单因素方差分析可知同一NH4+-N处理36陋v爹uR，——￡一一co叫coo盈。盛啦～8珊。口c矧DIIxc△—DJo—co．再=xc△—oJo—co．=xc△^，Jo—co一再_ol∞c卜啪枷{言啪{i享{||瑚狮瑚御凹。5叱8『。-山：cm芭口upIocD召Jeo口c碍D=xcA^匕。一co．曙=^c厶oLIo—co．=^LIA^)Jo—co一毋_o_毋c卜 4NH4+-N代谢中浮萍的生理学响应组内的光合色素没有显著性差异，说明随着处理时间的增加浮萍体内光合色素变化不显著。各NH4+-N处理组分别在0．5、1、2、3d达到峰值，这与各NH4+-N处理组浮萍的增长速率达到最高值的时间相同。这说明叶绿素的合成与生物量的增加有着密切的关系。试验初期培养液中NH4+．N来源充足，浮萍利用NH4+-N合成自身生长需要的物质，导致叶绿素的合成量增加；当培养液中NH4+-N缺乏时，浮萍自身合成的物质减少，使得叶绿素的合成量减少。各NH4+-N浓度处理组之间光合色素的变化没有显著性差异(P>0．05)，虽然浮萍叶绿素表现出与生物量具有较强相关性，但是浮萍生物量增加，单位浮萍中叶绿素含量却未发生显著改变。试验结果表明正常生长浮萍体内单位叶绿素含量趋于稳定，NH4+-N浓度的改变对叶绿素的影响不大。从图中还可以发现，浮萍体内单位胡萝卜素含量并未随着不同NH4+．N处理浓度的增加而变化，基本保持在200mg／gFW的水平。胡萝卜素是一种脂溶性抗氧化剂，可以作为自由基清除剂，具有保护叶绿素的功能(Kennetheat1．，2000)。因此，某种程度上说明，试验设定的各NH4+-N处理组并未对浮萍叶绿素合成产生明显破坏。拿，‘口詈￥豆曼旦墨品图4．4不同NH4+-N浓度下浮萍体内SP含量的变化Fig．4．4ChangesofSPcontentwithdifferentconcentrationsofNH4+-N不同NH4+-N浓度下浮萍体内SP含量的变化如图4．4所示，随着培养时间的延长各NH4+-N浓度处理组浮萍体内sP含量呈现先增加后降低的变化趋势，并且同一NH4+-N处理组sP含量有显著性差异。低的NH4+-N浓度(0．5mmol／L、 重庆大学硕士学位论文1．0mmol／L)的处理组，第0．5d与第0d和第1d与第2d的SP含量有显著性差异，说明浮萍SP含量在第0．5天显著增加，而在第2d时SP含量显著减少。根据表4．1在0．5一ld期间浮萍的氮素同化能力较大，故SP处于较高的水平：NH4+-N浓度为2．0mmol／L的处理组，浮萍在2d以前浮萍的SP含量没有显著性差异，第2d以后SP含量显著下降，因此浮萍在2d以前同化N也+-N的能力较强。而在NH4+-N浓度为3．0mmol／L的处理组，浮萍在3d处发生了与2．0mmol／L的处理组相似的现象，说明了浮萍在第3d时浮萍对NH4+-N的同化能力最大，SP含量达到峰值。另外，随着初始Nrh+oN浓度的增加，SP峰值出现时间逐渐延后。这些试验结果表明，浮萍对不同浓度Nm+．n的同化作用具有一定差异，引起生理指标的变化所需要的时间不同。另一方面，当培养液中NH4+．N含量较少时，浮萍体内SP的合成受到影响。因此，NH4+-N营养水平和处理时间对SP含量的影响较大。从图中还可以看出，高NH4+-N浓度处理组中的浮萍体内SP含量高于低NH4十．N浓度处理组的值。说明，提高NH：-N浓度在一定程度上可促进浮萍体内SP的积累，提高浮萍体内SP含量。4．2NH4+-N代谢中浮萍体内氮代谢关键酶活性的变化NR是一种诱导酶，且它只有在NOs'-N溶液中经过一段时间的诱导才能逐步形成。所以当水体环境中没有NOs'-N存在时，NR活性很低。虽然NH4+．N的存在也会抑制硝酸还原酶的活力，但是根据前期试验发现，在给定NH4+-N作为单一氮素来源的培养液中，各NH4+．N浓度处理组的浮萍体内NR活性在检测线附近。因此，在该试验过程中未考察NR活性的变化。GS是植物同化NH4+-N的主要关键酶，并且NH4+．N的存在还可以刺激GS的活性。不同NH4+-N浓度处理时，浮萍体内Gs活性见图4．5。由图可知，各NH4+．N浓度处理组的浮萍体内GS活性随着处理时间的延长均先上升后下降，呈单峰曲线变化．，各NH4+．N处理组内随着处理时间的变化，GS活性有显著性差异。NH4+-N浓度为O．5mmoFL的处理组，从第0．25d到第0．5dGS活性显著增加而从第O．5d到第1d的GS活性显著性减少，在第0．5d浮萍体内GS活性达到最大值；NH4+．N浓度为1．0mmol／L的处理组，从第0．25d开始到第1d期间浮萍GS活性显著增加，ld过后GS活性又显著下降，表明浮萍在第1天时GS活性最大；NH4+-N浓度为2．0mmol／L的处理组，在l～2d期间时浮萍GS活性显著增加，在2d以后又迅速下降，表明浮萍在第2天时GS活性达到峰值；NH4+-N浓度为3．0mmol／L的处理组，在1～3d内GS活性快速增加，3d以后GS活性又降低，说明了浮萍的GS活性在第3天达到最二恕。各NH4十制处理组浮萍体内GS活性达到最大值的时间与浮萍增长速率、SP含量达到峰值的时间一致。这主要是由于试验开始时NH4+-N作为GS 4NH4+-N代谢中浮萍的生理学响应的底物，可以诱导GS活性提高，带动了浮萍体内NH4+-N代谢的运转，促进了氨基酸和SP的合成。在试验后期，培养液中NH4+-N基本被浮萍吸收完毕时，浮萍不能够从水体环境获得足够的NH4十．N，使GS活性逐渐下降。高浓度NH4+-N处理组GS活性达到峰值的时间延后，这可能是由于在高浓度NH4+-N环境中，浮萍需要一定时间通过自身调节适应环境所致。还可以从图4．5看出，随着培养中初始NH4+-N浓度的增加GS活性呈现增加的趋势。由单因素方差分析可知低NH4+-N处理组(O．5mmol／L和1．0mmol／L)之间GS活性没有显著性差异，而高NH4+-N处理组(2．0和3．0mmol／L)之间GS活性有显著性变化。说明了低的初始NH4+-N浓度对GS活性增加不明显，高的初始NH4+-N浓度刺激浮萍体内GS活性的增加，提高浮萍同化利用氨氮的能力。因为当水体环境中NH4+-N浓度较高时，浮萍从水体环境中吸收较多NH4+．N，激活了GS活性，促进了浮萍体内NH4+．N转变成有机氮。f拿．兰旦e，詈石E3‘，)oTime(d)图4．5不同NH4+-N浓度下浮萍体内GS活性随时间的变化趋势Fig．4．5ChangesofGSactivitywithdifferentconcentrationsofNH4+-N4．3浮萍体内各种生理指标之间的相关性分析浮萍不同指标之间相关性分析如表4．2所示。各NH4+-N浓度处理组中浮萍体内的SP含量与叶绿素含量呈现极显著正相关。叶绿素分子中还有氮，它是由谷氨酸在一系列酶作用下转化形成的，所以叶绿素含量与SP含量有着密切的关系，即SP含量在一定程度上反映了叶绿素的合成能力，而叶绿素水平的变化对植物的新陈代谢有显著的影响(MishraandAgrawal，2006)o39 重庆大学硕士学位论文表4．2不同浓度NH4+-N下浮萍体肉各种生理指标之闯的相关性(N：6)Tab。4．2CorrelationsamongphysiologicalindexesunderdifferentNI-h+-Nconcentrations(N嗡)1．Ommol甩生物囊叶绿素含量SP1．。619一．914"1。866*lGS．140．681．243l3．Ommol／L生物量叶绿索含量SPGS1．020一．485．2121．844*．913幸1．722t．在0．05水平(双铡)上显著相关。¨．在。01永乎(颓侧)上显著相关。从表4．2还可以得出，各N时埘浓度处理组中浮萍的SP含量与GS活性之间的相关关系不：显著，说明GS活性的高低与SP的合成关系不明显。在低NH4+-N浓度下(1．Onmlol／L)的处理组浮萍的SP与生物量呈现显著负相关，即低NH4+．N浓度下，浮萍体内的单位SP含量并来随着生物量增加丽增大，甚至表现为下降，这是因为N弛+忒浓度较低时，能够被利用的外环境的氮素有限，浮萍优先利用氮素合成细胞物质，用于生物量的增加，雨Sp在该过程中受到一定影响，表现为单位sP含量下降。另一方面，在外环境氮豢不足的情况下，浮萍体内的有机氮和在液泡、叶绿体肉储存的有机氮(含氨基酸)将被分解，用于浮萍生长需要，影响了蛋自质的含量，造成SP的下降。低NH4+城浓度下，浮萍GS活性与叶绿素含量之间没有相关性，而在高N№十-N 4NH4+-N代谢中浮萍的生理学响应浓度下浮萍GS活性与叶绿素含量之间达到显著或者极显著正相关，即高NH4+-N浓度处理下，GS活性的高低与叶绿素的合成关系密切，较高的GS活性有利于叶绿素的合成。这是因为叶绿素的成分之一就是氮素，而GS酶的代谢产物谷氨酸在一系列酶的作用下转化为叶绿素，因此，高浓度NH4+-N条件下，GS活性较高，NI-h+-N的同化为谷氨酸能力也增强，促进了叶绿素的合成。4．4，J、结1)在四种不同NH4+-N浓度处理组中，随着培养时间的延长，NHa+-N浓度下降，浮萍的生物量增加，且浮萍对NHa+-N的吸收速率及其增长速率呈现出先增加后降低的趋势；浮萍的最大增长速率分别出现在0．5、l、2、3d，分别为0．209、0．352、0．382、0．432g'd～。随着培养液中NH4+-N初始浓度的增加，浮萍的初始增长速率呈现增加的趋势，并趋于稳定。2)在同一NH4+-N处理浓度下，随着培养时间的延长，浮萍体内的总叶绿素和SP含量呈现先增加后降低的趋势。不同的NH4+-N处理浓度对光合色素的影响不大，但对SP含量的影响较大。通过提高NH4+-N处理浓度可以促进浮萍体内SP的积累。3)在同一NH4+_N处理浓度下，随着培养时间的延长，浮萍体内GS活性呈先增加后降低的趋势。在不同的NH4+．N处理浓度下，高NH4+-N处理浓度能够刺激浮萍体内GS活性的增加，提升浮萍同化利用NH4+．N的能力，带动浮萍体内NH4+-N代谢的运转，促进氨基酸和SP的合成。4)在不同NH4+-N浓度处理组中，浮萍体内的SP与叶绿素含量存在极显著正相关关系。低NH4+．N浓度下，浮萍体内SP含量与生物量呈现显著负相关关系。高NH4+-N浓度下，浮萍体内GS活性与叶绿素含量之间呈显著或极显著正相关关系。41 ～————————————里丛塑主堂垡鲨塞42 5N03"-N代谢中浮萍的生理学响应N03--N代谢中浮萍的生理学响应N03"-N呈现氧化状态，带有负电荷，细胞对它的吸收是一个逆电化学势梯度的主动吸收过程，过程中需要消耗能量。N0f-N在进入植物体后，一部分N03‘-N被“贮备”在植物细胞的液泡中，在液泡中有时达到较高的浓度也不会对植物产生不良影响；还有一部分被还原为NH4+-N，并在细胞质中进行代谢。在植物的营养生长阶段N03"-N在植物体内会产生积累，随着植物的不断生长，植物体内的硝态氮含量会消耗净尽将会大幅下降。N03"-N被还原为NH4+-N的过程是经过硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶叫IR)催化的。N03"-N同化的主要途径是：N03"-N被吸收到细胞内后，第一步发生在细胞质中，在NR的作用下转化为N02--N，形成的N02"-N以分子态透过质膜；第二步N02"-N在叶绿体或前质体内在NIR的作用下被还原为NH4+-N，生成的NH4+-N在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下经GS／GOGAT(谷氨酸合成酶)循环生成各种有机氮。同化途径如图5．1。在NR、NIR这2种酶的连续作用下植物体内没有明显的N02‘．N的积累。．媳，●。_一，_“⋯-：勘瞻删l●州阳州哺IIt_，一。“瓣．一一∥如图5．1氮素的吸收和同化途径Fig．5．1N03。-Nuptakeandassimilationpathways在本章中选用浮萍为试验对象，设置不同初始N03"-N浓度，通过定期测定培养液中的N03"-N浓度和浮萍的各生理指标，试图了解不同N03"-N浓度下，浮萍的生长情况及浮萍对N03--N的吸收能力，还考察了氮素关键酶在N03"-N代谢过程中的作用及影响效果。43 一———————里曼塑些鲨墼5·1NO．3"-1卜丁代谢中浮萍生物量、光合色素及SP含量的变化5·1·1培养液中N03。一N浓度和浮萍的生物量的变化趋势"lqme(d)—I一0·5mmol／L卜1．Ommol／o．5mmol吻．0mmoI／L●＼、、＼、＼、、、、、囫、＼、豳饧＼、2Time(d)P、一甥∞E．g∞图5．2培养液中N03"-N浓度和浮萍的生物量的变化Fig·5·2ChangesofbiomassandN03‘-NconcentrationinwithdifferentN03．．Nconcentralions图5．2描述了培养液中N03--N浓度和浮萍的生物量随着培养时间的变化。从图5．2中可以看出，各N03"-N处理组培养液中的N03‘．N浓度随着浮萍吸收时间的延长呈现下降趋势，而各N03-N处理组浮萍的生物量随着培养时间的增加呈上升一曲E一∞竹∞Eo苗32●牿∞打博玑乱(1，口E—coIl罡芒9。coo旦窭_IIz 5N03"-N代谢中浮萍的生理学响应趋势。这是因为浮萍可以吸收利用培养液中的N03。-N，用于合成自身生长的物质，导致了浮萍生物量的增加。N03"-N浓度变化曲线斜率中处理初期的斜率大于处理后期，并且随着培养液中N03"-N初始浓度的增加逐渐增大，表示浮萍对N03’-N的初始吸收速率呈现增大趋势。这与表5．1显示的浮萍的增长速率的变化趋势一致。由表5．1可知，各不同N03"-N浓度处理组浮萍的增长速率随着处理时间先增加后降低，各N03"-N处理组浮萍的增长速率分别在1、2、3、4d时达到峰值，最大值分别为0．166、0．379、0．403、0．5189．d～。这是因为试验初期培养液中N03"-N浓度较高，浮萍可以吸收N03"-N的数量较多，造成培养液中N03’-N浓度降低迅速，此时浮萍把吸收的N03--N用于合成自身生长需要的物质，因此浮萍生物量增长速度较快；当培养液中N03"-N含量匮乏时，浮萍没有充足的氮素利用，所以浮萍对N03"-N的吸收速率下降，浮萍的增长速率也随之下降。从表5．1还可以看出，随着培养液中N03"-N初始浓度的增加，浮萍的初始增加速率呈现增加的趋势。表明高浓度N03"-N处理下的浮萍生长状态良好，浮萍生物量迅速增长。表5．1不同NOf-N浓度处理组的浮萍的增长速率Tab．5．1GrowthrateofduckweedtodifferentconcentrationsofN03。-N5．1．2不同N03"-N浓度下对浮萍体内叶绿素和sP含量的影响叶绿素是一类与光合作用有关的最重要的色素。它在光合作用的光吸收中起核心作用。图5．3描述了不同N03"-N浓度下浮萍体内各种叶绿素和胡萝卜含量随着培养时间的变化。浮萍体内总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素的含量随着培养时间的延长变化趋势基本一致，均呈现先上升后下降的趋势。低N03"-N浓度处理组在第1d时叶绿素含量达到最高值，高N03"-N浓度处理组在第3d时叶绿素含量达到峰值。各N03"-N处理组叶绿素的变化趋势与浮萍的增长速率的变化趋势相同，均在同一天达到曲线的最高点。这说明了叶绿素的合成与生物量的增加45 ～——————j墼型燮茎有着密切的关系，即叶绿素含量在一定程度上反映了植物同化N03-．N的能力。造O吣r-sXC鼠垂一、-，主要里螽6翟差藿g8毛翟一啊I∞0∞C卜(8)D^CA冀主重量§6暑差重028董暑∞om￡卜-Time(d)(总叶绿素：圆形：’叶绿素a：菱形；叶绿素b：正三角形；胡萝卜素：倒三角形)图5．3不同N03‘一N浓度下浮萍体内叶绿素和胡萝卜素含量的变化Fig·5．3changesofph。t。syntheticpigmentc。ntentwithdifferentN03"-Nc。ncentratiOns成叶绿素含量这种变化趋势的主要原因是培养液中N03-N的含量。试验初期培养液中N03。-N来源充足，浮萍吸收N03。-N合成自身生长需要的物质，致使叶绿素 5N03-N代谢中浮萍的生理学响应的合成量增加；当浮萍吸收一段时间后，培养液中N03。．N缺乏时，浮萍自身合成的物质减少，使得叶绿素的合成量减少。氮素含量直接或间接影响光合作用，即叶绿素的形成主要依靠细胞提供氮素(赵平等，1998)。各N03‘-N浓度处理组之间光合色素的变化没有显著性差异(P>O．05)。虽然叶绿素的合成与生物量的增加有着密切的关系，但是单位重量的浮萍中叶绿素含量并未显著改变，说明N03"-N浓度对叶绿素的合成影响不大。从图中还可以发现，浮萍体内单位胡萝I-素含量并未随着不同N03"-N初始处理浓度的增加而变化，基本保持在较低的水平，在160～260medgFW范围内。胡萝卜素是一种脂溶性抗氧化剂，可以作为自由基清除剂，具有保护叶绿素的功能。因此，某种程度上说明，试验设定的各N03’-N处理组并未对浮萍叶绿素合成产生明显破坏。}，詈窨￥旦2IX．Time(d)图5．4不同N03"-N浓度下浮萍体内SP含量的变化Fig．5．4ChangesofSPcontentwithdifferentconcentrationsofN03。一N图5．4浮萍体内SP含量变化。由图5．3可知，随着培养时间的增加各N03。-N处理组浮萍体内SP含量呈现先增加后降低的变化趋势。这是因为试验初期N03"-N含量较多，可供浮萍同化吸收合成浮萍自身需要的营养物质，导致SP含量上升，当培养液中N03--N含量较低时，浮萍转化合成的营养物质减少，使得SP含量减少。同一个处理组经过Duncan多重极差检验分析，结果表明各处理组内随着时间的变化，SP没有明显差异，即培养液中N03‘．N含量的下降对短时间内对浮萍体内的可溶性蛋白含量影响不大。不同处理组内SP含量随着N03‘-N浓度的增加逐渐增加，但是增加的幅度不大，组间差异性不显著(P>0．05)。实验结果表明培养液47 重庆大学硕士学位论文中N03‘-N含量对浮萍体内SP的合成影响不明显。5．2N03"-N代谢中浮萍体内氮代谢关键酶活性的变化f．曼E≥，’CbE分三星3芷ZTime(d)图5．5不同N03"-N浓度下浮萍体内NR活性随时间的变化趋势Fig．5．5ChangesofGSactivitywithdifferentconcentrationsofN03。-N植物体内NR活力的大小直接影响介质中N03"-N的利用，被作为植物的营养指标之一(张瑞珍等，2003)。由图5．5可以看出，不同N03"-N浓度处理的浮萍体内NR活性随着处理时间的延长均呈现先上升后下降的趋势。同一个处理组经过Duncan多重极差检验分析后得出同一处理组内的NR活性有显著性差异。结果显示，N03"-N初始浓度为0．5mmol／L的试验组，在第O．5d至第1d期间NR活性显著增加，在第l至2d期间NR活性显著下降，表明该组NR活性在第1天时达到最高值：N03’-N初始浓度为1．0mmol／L的试验组，在第0．25d至第1d期间NR活性显著增加，在第1至2d期间NR活性显著下降，表明该组NR活性在第0．25至第1天时NR活性较高；N03‘-N初始浓度为2．0mmol／L的试验组，在前3dNR活性没有显著变化，而第3至4d期间NR活性显著下降，表明该组NR活性在3d之前浮萍NR活性均保持在较高的水平上；N03"-N初始浓度为3．0mmol／L的试验组，在前4d浮萍体内NR活性没有显著变化，而第4至5d期间NR活性显著下降，表明该组NR活性在4d之前浮萍NR活性均保持在较高的水平上。NR活性达到较高水平的时间与表5．1中描述的浮萍的增长速率达到最高时的时间一致。因为试验初期培养液中N03。-N水平较高，使浮萍吸收N03"-N能力增强，诱导NR活性，从而浮萍的增长速率增加；吸收到一定程度后培养液中N03"-N变得匮乏，从而使NR48 5N03"-N代谢中浮萍的生理学响应活性下降，合成的生物量即浮萍的增长速率也随之降低。还可以从图5．5中看出随着培养中N03"-N浓度的增加浮萍体内NR活性也增加，不同N03--N处理组之间浮萍体内的NR活性差异显著(P<0．05)。结果表明了培养液中初始N03"-N的增加可以促进浮萍体内NR活性升高。硝酸还原酶是N03"-N同化的关键酶之一，是一种N03"-N诱导酶同时也是限速酶。图5．2中所示增加初始N03"-N浓度，浮萍生物量也随之增加，即浮萍同化N03’-N的能力增强，所以会提升NR活性来促进N03。-N的合成。p：c，．E旦仑口■西E—oEi、-一∞(，Time(d)图5．6不同N03-N浓度下浮萍体内GS活性随时间的变化趋势Fig．5．6ChangesofGSactivitywithdifferentconcentrationsofN03"-NGS是植物氮代谢关键酶之一，并参与多种氮代谢的调节。不同N03"-N浓度处理时，浮萍体内GS活性的变化见图5．6。由图可知，不同N03"-N浓度处理的浮萍体内GS活性随着处理时间的延长均先上升后下降，呈单峰曲线变化。提高GS活性可以加强氮代谢的运行，促进氨基酸的合成和转化。实验开始时GS活性提高，带动了浮萍体内氮代谢的运转，促进了氨基酸的合成。当N03--N基本被浮萍吸收完毕时，浮萍不能够从水体环境中吸收硝态氮，导致体内的生成的NH4+．N减少，从而使GS活性发生下降。由于N03"-N的同化首先要经过NR、NIR的作用生成NH4+-N之后，才会在GS的作用下生成氨基酸，故N03"-N对GS活性能够间接造成影响。经邓肯氏多重极差检验分析发现，各处理组内随N03。一N浓度变化并未造成浮萍的GS活性显著性差异。另外，根据差异性分析发现，不同处理组N03"-N浓度下各GS活性没有显著差异(p>0．05)。因此，N03’-N浓度虽然能够对GS活性造成一定影响，但影响不大。49 重庆大学硕士学位论文尽管随培养液中N03。．N浓度的增加浮萍体内GS活性没有显著变化，但相比低浓度下GS活性，高浓度下有所增加。在高N03"-N初始浓度时，浓度变化对浮萍体内GS活性增加不大。表明虽然NOa'-N的增大能够在某种程度上刺激浮萍体内GS活性的增加，但是高浓度并不能明显提升GS的活性。5．3浮萍体内各种生理指标与氮代谢酶之间的相关性分析浮萍中不同指标之间相关性分析如表5．2所示。各N03"-N㈣II(除2mmol／L夕l-、浮萍的SP含量与叶绿素含量基本呈现显著正相关或者极显著正相关，即在N03"-N为氮素来源时，叶绿素随着SP含量的增加而增加。叶绿素是由谷氨酸在一系列酶作用下转化形成的，叶绿素分子中含有氮素，造成叶绿素含量与sP含量有着密切的关系。在高N03’-N浓度处理组(1、2、3mmol／L)中浮萍体内SP含量与NR活性呈现显著和极显著正相关，说明NR活性可以促进浮萍体内SP的合成。浮萍NR活性水平较高时，同化N03。-N的能力较高，此时可以合成较多氨基酸，导致SP含量的增加。从表5．2中还可以发现，NR活性与叶绿素含量呈正相关关系，且随着处理组初始浓度的增加，NR活性与叶绿素含量相关性系数逐渐增大，并在N03"-N浓度为3mmol／L的处理组出现显著相关。表明随着环境中N03"-N浓度的升高，浮萍体内NR活性与叶绿素的合成关系逐渐密切，高N03"-N浓度时NR活性促进了叶绿素的合成。这主要是由于培养液中N03"-N浓度较高时，NR活性增强，合成的有机氮如谷氨酸数量增加|，由谷氨酸转化成叶绿素含量也随之增加。从表5．2还可知，生物量与叶绿素、SP、NR均呈现不显著负相关。说明浮萍体内的NR活性、单位SP含量和叶绿素含量并未随着生物量增加而增大，甚至表现为下降，这是可能是因为当N03"-N为氮素来源时，浮萍吸收N03"-N合成自身物质，使得生物量、叶绿素含量、SP含量和NR活性的增加，但是，生物量增加的幅度较大，而SP和叶绿素含量以及NR活性增长的幅度较小，表现为单位生物量的SP和叶绿素含量以及NR活性下降。表5．2不同浓度N03"-N下浮萍体内各种生理指标之间的相关性fN=6)Tab。5．2CorrelationsamongphysiologicalindexesunderdifferentN03‘一Nconcentrations(N=6) 5N03"-N代谢中浮萍的生理学响应浓度指标生物量总叶绿素SPNRGS生物量1叶绿素含量一．04912．0mmol／LSP．．551．818+1NR．．713．717．915木1GS．755．467．089-．1931十．在O．05水平(双侧)上显著相关。”．在．Ol水平(双侧)上显著相关。5．4，j、结l、在四种不同N03-N浓度处理组中，随着培养时间的延长，N03-N浓度下降，浮萍的生物量增加，且浮萍对N03-N的吸收速率及其增长速率呈现出先增加后降低的趋势；浮萍的最大增长速率分别出现在1、2、3、4d，分别为O．166、0．379、0．403、O．5189．d～。随着培养液中N03--N初始浓度的增加，浮萍的初始增长速率呈现增加的趋势，并趋于稳定。21在同一N03-N处理浓度下，随着培养时间的延长，浮萍体内的总叶绿素和SP含量均呈现先增加后降低的趋势，但不存在显著差异。在不同N03’-N处理浓度的培养液中，高初始浓度有利于促进光合色素的合成，但对SP的合成影响不大，故浮萍受水环境中N03‘-N影响较小。3、l在同一N03--N处理浓度下，随着培养时间的延长，浮萍体内的NR活性发 重庆大学硕士学位论文生显著变化，GS活性没有明显变化。在不同NO；-N处理浓度的培养液中，初始N03--N浓度的增加有利予促进NR活性，但对GS活性影响较小，故在浮萍修复过程中，NR．活性可以用子表征水体中N03-N浓度变化。4、)在不同N03"-N浓度处理组中，浮萍体内叶绿素与SP含量关系密切。在高的NO；-N处理浓度下，浮萍体内NR活性与SP含量呈显著和极显著正相关，与叶绿素含量呈显著相关。高N03"-N浓度利于提高NR活性，促进浮萍体内叶绿索的含成。52 6结论与建议6结论及建议6．1结论本文以浮萍为研究对象，在最适合浮萍生长的环境条件下研究了不同浓度和不同形态氮素对浮萍的吸收状况、生长状况和生理生化反应代谢的影响，通过统计分析和相关的研究结果分析，主要研究结论如下：11浮萍在0．5～3mmol／LNH4+-N浓度范围均都能正常生长，但是当NH4+-N浓度大于3mmol／L时，浮萍虽然表观生长正常，但酶学指标却表明NH4+-N对浮萍产生了胁迫效应。SOD活性的大小可以用于指示浮萍受到高浓度NH4+-N胁迫的程度。2)时间依赖试验表明：同一NI-h+-N处理浓度下，随着培养时间的延长，浮萍吸收培养液中NH4+-N合成自身生长所需物质，使其生物量增加；浮萍体内SP含量和GS活性均发生显著变化，而光合色素含量基本稳定。浓度依赖试验表明：不同NH4+．N初始浓度下，浮萍体内光合色素含量变化不显著，但是叶绿素含量与SP含量之间存在密切关系。高浓度NH4+一N促使浮萍体内GS活性增加，从而促进叶绿素和可溶性蛋白含量的合成。根据相关性分析可知，在各NH4+-N处理浓度下，浮萍体内SP与叶绿素含量存在极显著正相关关系；低NH4+-N浓度下，浮萍体内SP含量与生物量之间呈显著负相关关系。高NH4+．N浓度下，浮萍体内GS活性与叶绿素含量之间呈显著或极显著正相关关系。31时间依赖试验表明：同一N03--N处理浓度下，随着培养时间的延长，培养液中N03"-N浓度下降，浮萍的生物量增加；浮萍体内NR活性发生显著变化，而叶绿素、SP含量和GS活性变化不显著。浓度依赖试验表明：在不同N03"-N处理浓度的培养液中，高的初始浓度诱导NR活性的提升，但对叶绿素、SP含量和GS活性影响不大。相关性分析结果表明，浮萍体内叶绿素与SP含量关系密切；在高的N03"-N处理浓度下，浮萍体内NR活性与SP含量呈显著和极显著正相关，与叶绿素含量呈显著相关。6．2建议1)本试验研究了浮萍分别对单一N03"-N和单一NH4+-N的吸收富集作用，建议后续试验把不同氮素形态设置一定的比例，研究浮萍不同比例的N03"-N和NH4+-N的吸收富集作用。2)本试验研究不同氮素水平对浮萍生长以及代谢酶活性的影响，但是没有解决浮萍体内酶活性变化的原因，建议后续试验研究不同氮素水平对浮萍体内代谢酶基因表达量的影响。 ～———————』型塑螋塞一彳。：?烹兰警兰磐-中要用的浮萍没有分离出新生、正常、衰老的叶状体，考察这三竺兰竺竺要苎耋的的平均影响，建议后续试验分离出这三种不同晶本状葆_亲索哪种叶状体对氮素代谢影响起决定作用。～⋯’“” 致谢在本论文完成之际，我向所有在学习和生活上给予我帮助的老师和同学致以最真挚的敬意；并对所有孜孜不倦奋斗在文献前、实验台边或是在野外采样过程中的科学研究者们表示尊敬。我的论文能够完成得益于我的导师高旭教授。在硕士论文进行期间，老师不断不断给我鼓励，在课题思路上给予引导，培养我不断发现问题、解决问题的能力。总而言之，感谢他给予自己的锻炼机会和对于自己成长的帮助。非常感谢黄磊师兄对自己课题的不懈指导和在生活上面的关心帮助，没有他的支持和帮助，课题很难顺利完成；感谢课题组其他老师在课题组会上给予的指导和在生活工作上给予的关心；感谢师弟刘明、杜刚、鲁言言、紫成方和师妹张蕾给我实验上的帮助；感谢已经毕业的陈俊宏师兄和谢伟丹师姐给予的宝贵经验和关怀。感谢2009级课题组中李珊、郭松松、翟晓敏、谢丹等同学，感谢他们在生活和学习上的许许多多、点点滴滴的帮助，也感谢他们创造了很多快乐的时刻，感谢他们。最后，特别感谢我的家人，一直以来，他们无微不至的关心我的学习和生活，鼓励和支持我不断进步，学业的圆满完成是我对他们做好的回报，谨以此文献给我的家人!马晓霞二0一二年四月于重庆 56 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