四川松针散斑壳菌的种群结构及其遗传分析

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1、四川松针散斑壳菌的种群结构及其遗传分析摘要松树是北半球最重要的森林树种，在中国的分布遍及全国，包括引进栽培种在内共有38种12变种，四川是全国松树种类最多的省区，有7种2变种，主要有云南松、马尾松、华山松、油松、高山松、湿地松、白皮松、思茅松等。四JII林区是青藏高原东部林区的重要组成部分，其森林植被是维系长江流域生态平衡的主要天然屏障。松落针病也是世界常见病害之一，主要危害松树苗木、幼林和成林，轻者引起松树部分松针枯死、脱落，重者可引起70％以上松针枯死脱落，严重影响松树的生长，材积损失率可高达80％，甚至导致松树整株枯死。松落针病也是我国松树林区常见病害，分

2、布广，危害重，长期以来受到学者的高度重视。引起松落针病的病原菌是散斑壳属真菌，该属为斑痣盘菌科中最大一个属，已报道有100多个种，可在多种针叶树和阔叶树上寄生。由于该属真菌分布地域广，寄主种类多，其系统发育及种的分类鉴定也备受人们关注，松树生散斑壳菌的研究也是国内外学者研究的重点。本文是历经多年对四川松树落针病进行调查分析，并着重对松落针病病原菌的种类及其遗传多样性、系统发育关系进行全面系统的研究，以期完善我国松生散斑壳属真菌的研究、为维护四川林区森林健康及松落针病的防控提供科学依据。1．参照Minter提出的松生散斑壳菌形态分类依据，对采自四川近20个市县的样

3、品进行分类鉴定，共鉴定出散斑壳属真菌7种，即针叶树散斑壳(LophodermYumconigenum)、松针散斑壳(Lophodermipinastri)、四川散斑壳(Lophodermjuxsichuanens曲、印度散斑壳(Lophode2仞iumindianum)、南方散斑壳(Lophodermiu田australe)、--ag山散斑壳(Lophodermiumerlangshanense)(待发表新种)、库茂恩散斑壳(Lophodermiumkumaunicum)。并根据主要形态分类特征提出了四川松生散斑壳菌种的分类检索表。2．以随机采取400颗松针统计

4、针叶上是否有子囊果的方法，对来自四川松树林区29个采样点的样品进行统计分析表明，四川松树林区均有不同程度的落针病发生，其发病率可高达50％以上；针叶树散斑壳、松针散斑壳2个种在云南松、马尾松、湿地松、高山松、华山松上均有出现，且常有混生现象，在云南松、湿地松和马尾松上落地针叶上均有印度散斑壳菌存在，而南方散斑壳菌只在湿地松针叶上出现，库曼散斑壳菌只在高山松上出现，但数量不多；四川散斑壳茵只在二郎山云南松活针叶上有发现，二郎山散斑壳菌只在二郎山和康定跑马山的华山松活针叶和脱落针叶上有发现，数量较少。I3．采用子囊果组织分离法对采自四川各地松针散斑壳菌材料进行分离培

5、养，共获得菌株24个(编号L01至L-24)，并对其培养菌落形态特征进行了描述。通过降低养分浓度、改变碳源、更换不同种类的培养基等方法对生长于PDA平板上的散斑壳菌株进行子囊孢子诱发实验，23℃条件下培养60d后均无有性态产生。4．采用改良二次沉淀法和改良氯化苄法提取散斑壳茵培养物总DNA，用于RAPD分析和ITS测序，其结果证明改良后的二种DNA提取法均能满足分析测试要求，改进方法是：在DNA提取之前，将各菌株培养物的菌丝体放入-20℃冰箱冷冻保存12小时以上，然后将冷冻后的菌丝体置于研钵中研磨，再加入相应的提取液。5．从160条RAPD引物中通过初筛、复选，

6、共筛选出11个引物用于24个散斑壳菌株的RAPD分析，并对PCR反应条件进行了优化，其最佳反应条件是：25斗IPCR反应体积，lOXTaq酶缓冲液(2．5p1)，1．5UTaq酶，20ngDNA模板，0．4mmol／LdNTPs，4．Ommol／LM92+，0．48pmol／L引物，i0．2ptddH20。6．利用11个引物对24个菌株进行RAPD分析，共扩增出217个位点，其中多态性位点214个，占总数的98．6％，表明四川散斑壳菌遗传多样性非常丰富。对扩增结果采用UPGMA法进行聚类分析得到24个菌株的相似性系数聚类图。聚类图显示，在相似性系数为0．28处，

7、所有的供试菌株被分为I、II、IⅡ、Ⅳ和V5类。其中，第1类又可分为I—l和I一2两个亚类；I—l类包含了形态学上具有较多共同特征的L．pYnastri，厶conigenum两个种。第Ⅳ类和第V类因相似率很低而与其它类群分开，同样也应证了分子生物学与形态学的相关性。将寄主同为马尾松的￡．conigenum各菌株单独进行分析，聚类结果显示同一种内各菌株由于地域分隔而产生较大的遗传分化；对来源于泸定二郎山林场的L．pinastri和L．conigenum种内各菌株构建相似性系数矩阵，结果表明，寄主来源不同可能造成种内不同程度的遗传分化。7．利用真菌通用引物ITS，、

8、ITS。成功对18个四川