半滑舌鳎皮肤溃疡病病原及免疫保护的研究

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1、学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人(签名)：挑矗’筻时间：功／7．占．，《P保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的

2、全部或部分内容。作者(签名)：挑志键导师(签名)：}】亏秒朋名，时间：沙、嘶MI供狡半滑舌鳎皮肤溃疡病病原及免疫保护研究摘要半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGtinther)个体大、生长快、肉质鲜嫩、营养丰富，其品质和经济价值位居鳎类之首，当前，其人工养殖产业已初具规模，然而，养殖过程中出现的各类疾病则给养殖生产带来负面影响。皮肤溃疡病是近年来在养殖半滑舌鳎中新出现的一种细菌性疾病，本文对其病原进行研究，并以分离鉴定的致病菌为基础进行了灭活疫苗和减毒疫苗的制备及相关免疫保护效果探

3、讨，目的在于了解该病原的生物学特性并为该病的绿色防控积累资料。从患有皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶分离得到4株优势菌，经人工注射感染证实菌株A3、BVl为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的主要病原，其半数致死量LD50分别为1．5×104’2cfu／mL、6．7×103cfu／mL。对这2株致病菌进行了形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及对抗菌类药物的敏感性等生物学性状的研究与分析。同时，测定它们的16SrRNA、gyrB基因序列，分析其相应序列的同源性并构建系统发育树，结合菌株A3、BVl的生理生化

4、特征和16SrRNA、gyrB基因序列分析，确认这两株菌分别为哈维氏弧菌(I辱brioharveyi)和轮虫弧菌(矿rotiferianus)。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明，菌株A3具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性，在含有4％羊血的TSA平板上呈D溶血活性；菌株BVl具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶和卵磷脂酶活性，而不具有蛋白酶和明胶酶活性，在含有4％羊血的TSA平板上呈p溶血活性。药物敏感性分析结果显示，菌株A3对四环素、强力霉素、氟哌酸、磺胺异恶唑、氧氟沙星、

5、新生霉素、萘啶酸、氟啶酸和左氧氟沙星敏感，而对其他抗生素低度敏感或具有一定的抗性；菌株BVl对链霉素、四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异嗯唑、复方磺胺甲嗯唑、萘啶酸和左氧氟沙星敏感，而对其他抗生素低敏或具有一定的抗性。以上述致病性哈维氏弧菌为抗原，采用福尔马林灭活方法制备了灭活疫苗并接种免疫半滑舌鳎，通过检测受免鱼的血清凝集抗体效价、溶菌酶活性、酸性磷酸酶活性、血清补体活性、血清蛋白含量、头肾白细胞吞噬杀伤活性等免疫相关指标及机体针对该病原攻毒后的免疫保护力，发现半滑舌鳎经疫苗免疫后35d内血清中抗

6、体凝集效价呈现先升高后下降的趋势，但在免疫期间总体上保持较高的水平。同时，血清溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、血清蛋白含量与对照组相比都有明显的差异(尸<0．05)。接种疫苗30d后的病原攻毒试验表明，受免半滑舌鳎的免疫保护力可达60％。由此可见，哈维氏弧菌灭活疫苗对半滑舌鳎有较显著的免疫保护效应，可作为预防哈维氏弧菌感染的疫苗。为了进一步探讨减毒活疫苗对半滑舌鳎的免疫保护效果，首先利用利福平筛选了具有利福平抗性的减毒株，并分析其相关生物学特性。利福平处理后获得的减毒株菌落较小、生长缓慢、运动性较弱，通

7、过BIOLOG微生物鉴定系统检测该菌株对95种不同碳源的利用情况，结果显示野生菌株和减毒株的相似性为78．1％；在基因水平上，通过16SrRNA基因序列分析显示减毒株与野生菌株仅有一个碱基差异，表明筛选出来的减毒株在分类水平上并没有发生变化；REP．PCR分析则表明，减毒株与野生菌株具有相同的BOX和ERIC。PCR带型，而(GTG)5．PCR带型不同，减毒株的(GTG)5．PCR图谱比野生菌株多一条；用Sackosyal法提取细菌外膜蛋白，用酚水法提取LPS，比较了减毒株与野生菌株的OMP和LPS

8、的SDS．PAGE电泳图谱，结果显示减毒株的OMP和LPS带型与野生菌株不同，且条带数都明显减少。以上述具有利福平抗性的减毒株为免疫原经腹腔注射免疫半滑舌鳎并通过测定受免鱼的血清凝集抗体效价、溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、头肾白细胞吞噬杀伤活性、头。肾白细胞呼吸爆发活性、头肾白细胞MPO活性和NO活性等免疫相关指标及病原攻毒后机体免疫保护力来评价减毒疫苗对半滑舌鳎的免疫保护效果，结果表明，接种疫苗后28d内受免半滑舌鳎的血清中抗体凝集效价呈先升高的趋势，同时，血清溶菌酶