人重组il-24基因治疗乳腺癌的实验研究

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1、人重组lL-24基因治疗乳腺癌的实验研究中文摘要人重组

2、l一24基因治疗乳腺癌的实验研究中文摘要目的：(1)构建hlL．24原核表达载体pET-21a(+)．IL．24，并在大肠杆菌中进行表达，将获得的rhlL．24蛋白纯化复性，体外实验观察rhlL-24蛋白对乳腺癌细胞(MDA．MB．231细胞)生长抑制效应及诱导乳腺癌细胞凋亡的作用；(2)构建h／L．24真核表达载体peDNA3-hlL24，将其转染ClIO细胞并进行稳定表达，体外检测CHO细胞表达的rlffL-24蛋白对乳腺癌细胞(MDA．MB．231细胞)的抗肿瘤活性及诱导乳腺癌细胞凋亡的功能；(3)体外观察rhlL．24蛋白免疫刺激

3、及抑制血管形成的作用，进一步探讨rhlL-24蛋自的的生物学功能；(4)采用原核表达rhIL．24蛋白和pcDNA3．tdL．24真核质粒对裸鼠乳腺癌动物模型进行治疗研究，观察和比较两者治疗效果，探讨其治疗作用机理。方法：(1)以pBV220一IL-24载体(本室构建)为模板，以上游含有BamHI酶切位点，下游含有XhoI酶切位点的ML-24引物进行PCR扩增，将pET-21a(+)质粒和PCR产物双酶切后回收，T4DNA连接酶连接，氯化钙法转化DH5n感受态细胞，PCR鉴定重组子后测序。将测序正确的pET-21a(+)．IL．24重组质粒抽提后转化BL21菌株，挑取阳性克隆。加入IPTG(终

4、浓度为lmmol／L)，37"12诱导表达，将所得包涵体进行洗涤，溶包，复性后透析，获得纯化rhlL．24蛋白，Western-blot方法对其进行鉴定：采用MTT法观察rML-24蛋白对MDA-MB．231乳腺癌细胞的抑制效应；Hoeehst33258染色检测MDA—MB-231细胞凋亡形态；FCM检测MDA．MB．231细胞的凋亡率。(2)用KpnI和XbaI双酶切pUCl9-hlL-24质粒DNA，将其定向克隆至经KpnI和XbaI双酶切的pcDNA3真核表达载体上，以氯化钙法将构建的pCDNA3-klL．24质粒转化DH5a感受态细胞，用PCR方滔ff取酶嘶渖i方法鉴定重组子。采用阳离

5、子脂质体将pCDNA3．ML-24质粒转染CHO细胞。培养、传代至G418选择性培养基挑选阳性转染细胞克隆，RT-PCR及Westernbolt检测目的基因在CHO细胞中的表达：采用MTT法观察50％稳定转染pCDNA3一hIL．24质粒的CHO细胞上清的培养液对MDA-MB．231乳腺癌细胞的抑制效应；TUNEL染色检测人重组IL．24基因治疗乳腺癌的实验研究中文摘要MDA-MB一231细胞凋亡形态：FCM检测MDA-MB．23I细胞的凋亡率。(3)采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PMBC)，置于6孔板中培养，设置未经rhIL．24蛋白刺激淋巴细胞对照组及经rhlL-24蛋白刺激淋巴

6、细胞实验组，分别采用ELISA试剂盒检测IL一6、IFN．Y和TNF·a，观察rML。24蛋白体外对淋巴细胞免疫刺激功能；利用CAM模型，观察rhlL-24的血管形成抑制功能。(4)建立乳腺癌动物模型，随机分为四组，。采取肿瘤局部注射治疗，共治疗三周，治疗后第四周将裸鼠脱颈处死，取出瘤体。测量肿瘤重量、体积，计算抑瘤率；采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡形态；透射电镜观察肿瘤细胞凋亡的超微形态改变：免疫组化测定肿瘤cas口ase3蛋白的表达；采用CD34标记肿瘤血管内皮染色计算肿瘤微血管密度。结果：(1)构建的原核表达载体pET-21a(+)．IL．24，经双酶切和PCR鉴定原核表达质粒构建正确

7、．用IPTG诱导后，在大肠杆菌中获高效表达，经纯化、复性后的rhlL-24蛋自具有抑制MDA—MB-231细胞生长的作用，并能诱导MDA-MB．231细胞凋亡。(2)经双酶切和PCR鉴定pcDNA3．II，24真核表达质粒构建正确，以脂质体稳定转染CHO细胞后，用RT-PCR法、Westernbolt、MTT法、TUNEL染色和FCM检测表明CHO细胞可表达hIL-24，且所表达的人lL．24具有抑制MDA-MB-231细胞生长的作用。并能诱导MDA-MB-23l细胞凋亡。(3)rML．24刺激PMBC后，12-24小时能检测到TNF．o的存在。刺激48小时后，IL．6、IFN．Y的浓度渐上升

8、，至72小时分泌达到最高峰。与对照组相比，具有显著性差异(P<0．01)；在CAM血管形成抑制实验中，发现rhlL-24蛋白均可显著抑制血管形成。其中对二级和三级血管的抑制效果明显，与阴性组比较。差异显著。(4)动物模型分组治疗后，rML．24蛋白、pcDNA3．IL．24真核质粒对乳腺癌肿瘤治疗后肿瘤重量、体积、抑瘤率与NS阴性对照组相比有显著差异(PO．05