重组人腺病毒介导p53基因治疗人涎腺腺样囊性癌的体外实验研究

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1、重组人腺病毒介导p53基因治疗人涎腺腺样囊性癌的体外实验研究硕士研究生：倪成亮导师：林李嵩教授【摘要】目的：检测携带野生型p53基因的重组腺病毒颗粒(rAd-p53)体外转染腺样囊性癌细胞ACC—M后外源性p53的表达，观察rAd-p53转染ACC—M细胞后对其体外黏附、侵袭能力、迁移、增殖及化疗敏感性的影响，探讨rAd-p53治疗腺样囊性癌临床应用的可行性。方法：(1)利用携带野生型p53的重组腺病毒体外转染P53基因突变的腺样囊性癌细胞ACC-M，应用免疫细胞化学法检测外源性p53基因在ACC-M细胞中的表达

2、及转染效率；(2)应用倒置显微镜观察rAd-p53对ACC-M细胞形态学的影响；运用MTT法、划痕实验、Transwell小室法检测转染前后细胞黏附、迁移、侵袭能力的变化；(3)通过MTT实验观察rAd-p53对ACC-M细胞增殖的影响，再用荧光显微镜观察Hoechst33342和PI荧光染色后细胞核形态的改变；(4)通过MTT测定细胞存活率检测转染rAd—p53前后ACC-M细胞对紫杉醇敏感性的影响，应用流式细胞仪检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。(5)采用SPSS17．0软件包对数据进行单因素方差分析及t检验

3、。结果：1．外源性P53基因经腺病毒载体成功转入ACC-M细胞，细胞免疫组化法检出外源性p53的高表达，当感染复数MOI=100时，体外转染效率达到93．33％。2．转染p53基因后的腺样囊性癌ACC—M细胞较其亲代细胞的黏附、迁移、侵袭能力降低。3．rAd-p53能显著抑制ACC—M细胞增殖，MTT检测显示，rAd-p53在10,-,--200MOI浓度范围内，对ACC—M细胞的增殖抑制作用呈现时间依赖性和浓度依赖性(P

4、型的细胞核皱缩及凋亡小体。4．经rAd-p53转染的腺样囊性癌ACC-M细胞对紫杉醇的敏感性增强，IC50降低为转染前的1／12，rAd-p53可诱导腺样囊性癌ACC—M细胞凋亡及细胞周期GJG，期阻滞，联用组G。／G。期及G。／M期均显2著升高，且其S期下降较两单药组与空白对照组比较有极显著差异(P<0．01)。结论：1．重组腺病毒rAd-p53是高效的基因转移系统，能将野生型P53基因导入腺样囊性癌ACC-M细胞中。2．转染Wt-p53基因的腺样囊性癌ACC-M细胞侵袭能力、黏附能力及迁移能力明显降低。3．r

5、Ad-p53对ACC-M细胞产生强有力的增殖抑制及凋亡诱导作用，并且能有效阻滞细胞周期于G。／G。期。4．rAd-P53可增强ACC—M细胞对紫杉醇的敏感性，rAd—p53基因治疗可望成为晚期、无法耐受手术和大剂量放化疗及复发性腺样囊性癌患者的综合治疗方法之一。关键词腺样囊性癌基因治疗p53腺病毒药物敏感性3Effectsofrecombinantadnoviruscarryingwildtypep53geneonhumansalivaryadenoidcycistcarcinomacells：aninvitro

6、studyPostgraduate：NiChengliangSupervisor：ProfessorLinLisongAbstractObjective：Todetecttheexpressionofexogenousp53geneinhumanadenoidcycistcarcinomacelllineACC—MafterinfectedwithrAd—p53invitro；toinvestigatetheadhesion,invasive，migrationandproliferationabilityofA

7、CC-Mcellsinvitroafterp53genetransfectionandchemosensitivityofACC—Mcells；thenexplorethefeasibilityofclinicalapplicationofrAd-p53inthetreatmentofadenoidcyciStcarcinoma．Methods：(1)Recombinantadenoviruscarryingwild—-typep53gene(rAd··p53)Wasused．Theexpressionofexo

8、genousp53geneandtheefficiencyofadenovirusmediat--edgenetransferofrAd·-p53inACC—McellsWasdetectedbyimmunocytochemistry(ICC)；(2)ThechangesofmorphologicofACC—Mcellstransfected、析tlltAd-p53wer