基因芯片技术筛选和鉴定结直肠癌腹膜种植转移相关基因

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1、博士学位论文基因芯片技术筛选和鉴定结直肠癌腹膜种植转移相关基因博士研究生：刘峰指导教师：李国新教授摘要研究背景和目的腹膜种植转移是结直肠癌常见的转移方式，文献报道结直肠癌腹膜转移的发生率约13％，有7％的结直肠癌患者在首次手术时就发现腹膜种植转移，另有4％～19％的患者在根治术后出现腹膜种植转移。结直肠癌腹膜转移的预后很差，中位生存期只有5"9个月，因此，鉴定结直肠癌腹膜转移的生物学标记对早期诊断及判断预后都具有重要意义。基因芯片技术由于具有高通量检测基因表达变化的特点，所以被广泛应用于肿瘤生物学

2、标记的筛查。目前，大量研究证实结直肠癌原发肿瘤组织和肝脏、淋巴结转移组织中存在大量差异表达基因，但腹膜转移组织和原发肿瘤组织中有哪些基因存在表达差异，国内外报道甚少。理论上，根据肿瘤平行生长模型，在肿瘤发生的早期，一些不具有全部恶变基因的肿瘤细胞就可以出现播散，并在远处其他组织内继续通过基因突变来适应新的微环境的变化，最终形成转移灶，由于外部环境选择的压力和内在基因的不稳定性，使这些转移细胞的基因和原发肿瘤的基因差异很大。因此，借助于基因芯片技术比较结直肠癌原发肿瘤组织与腹膜转移组织全基因组mRN

3、A表达水平的差异，就可以找到结直肠癌腹膜转移相关的基因。为此，我们首先从南方医科大学附属南方医院普外科自主开发的结直肠癌外科病例管理与分析系统软件中提取748例结直肠癌病人数据，对临床病理资料进行回顾性分析，应用SPSS统计软件探讨结直肠癌腹膜转移发生的危险因素，并确定基因芯片实摘要验所需的病人及标本收集范围。采用基因芯片技术比较4例结直肠腺癌原发肿瘤组织和配对的4例腹膜转移组织全基因组mRNA表达水平的差异，通过倍数法确定差异表达的基因，并对这组基因进行功能注释聚类分析，通过对肿瘤进展相关的功能

4、类中基因的分析，探讨结直肠癌腹膜转移的分子机制。由于基因芯片技术有一定的假阳性率，因此对部分基因芯片技术筛选出的差异表达基因进行RT-PCR验证。通过上部分实验，我们最终确定胶原三股螺旋重复蛋白1(CollagenTripleHelixRepeatContaining1，CTHRC1)与结直肠癌腹膜种植转移密切相关，为近一步验证CTHRCl蛋白表达水平的差异，采用免疫组化的方法检测了40例正常组织、66例结直肠原发癌组织、42例腹膜转移癌组织及5年随访期内无腹膜转移发生的68例结直肠原发癌组织的C

5、THRCl蛋白表达情况，探讨CTHRCl蛋白表达与临床病理数据之间的关系，比较不同强度CTHRCl蛋白表达组间病人术后累积总生存率及无病生存率的差异，并以病人的临床病理数据及CTHRCl表达水平为自变量，构建Cox回归模型，最终证实CTHRCl蛋白表达阳性是影响病人术后生存的危险因素。除比较原发肿瘤组织与腹膜转移组织间差异表达基因外，还通过基因芯片技术比较了原发肿瘤组织和正常组织间的差异表达基因，并对部分基因进行RT-PCR验证。通过不同组织间差异表达基因的比较，有助于了解结直肠癌腹膜转移的分子机

6、制，寻找理想的腹膜种植转移标记物，从而为早期发现、预防及治疗结直肠癌的腹膜种植转移提供可靠的理论依据。方法第一章回顾分析2003年1月"～2008年12月南方医院普外科收治的结直肠癌患者的临床病理资料，根据术中探查及术后病理结果，将病人分为腹膜转移组和无转移组。通过比较两组病人间年龄、性别、肿瘤部位、大小、病理类型、分化程度、T分期、N分期、术前癌胚抗原(CEA)、血清糖链抗原19．9(CAl9．9)的差异，寻找结直肠癌腹膜种植转移的危险因素。第二章2010年4月到2010年12月在中国广州南方医

7、科大学附属南方医院手II博士学位论文术治疗结直肠腺癌伴腹膜种植转移病人4例，术中收集原发肿瘤组织和腹膜转移组织标本，浸泡于RNALater中常温保存。应用Trizol法提取总mRNA，经逆转录合成eDNA后经体外扩增合成aRNA后用Cy3荧光分子标记，标记后与人类全基因组表达谱芯片杂交，待芯片完全干燥后，利用扫描仪(LuxSean3．0，北京博奥)进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(GenePixPro6．O)，随后进行数据分析和处理。采用倍数法(≥2或≤O．5)确定配对标本间差异

8、表达基因，通过DAVID(TheDatabaseforAnnotation，VisualizationandIntegratedDiscovery)分析工具对这组差异表达基因进行基因功能的注释和基因富集分析，筛选出与肿瘤进展相关的功能类，在这些功能类中挑选差异倍数较高且参与多个功能类的基因进行半定量荧光RT-PCR验证。第三章收集2003年1月---2010年12月间广州南方医院普外科行手术治疗的结直肠腺癌伴腹膜转移病人的组织蜡块，获取正常组织蜡块标本40块，肿瘤原发组织蜡块标本6