以跨膜蛋白疏水结构域为多肽标签的目标蛋白酶定位研究

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1、中文摘要蛋白质分离纯化技术推动了对基因工程、分子生物学、免疫学和疾病诊断学等许多新兴学科的发展。随着生命科学和生物技术的不断进步，对于生物大分子分离和纯化的要求也越来越高。蛋白质常存在于复杂的混合体系中，对温度、pH、机械剪切力、酶等均非常敏感，稳定性较差，易于变性，故用于小分子的分离技术大多并不能直接用来分离蛋白质。本研究探索通过整合蛋白的跨膜结构域与材料表面的疏水相互作用达到蛋白分离的目的。整合蛋白约占各种生物体总蛋白的四分之一以上，这些整合蛋白牢牢嵌入到了脂质膜中，对于保持蛋白的疏水结构及其功能是必不可少的。到目前为止，大多数的整合蛋白的应用都与它们的生理作用有关。然而，事实上整合蛋白的

2、疏水结构也可以进行多功能方面的研究。在本研究中主要选用若干种整合蛋白的跨膜结构域以及全蛋白如枯草芽孢杆菌Mrp操纵子系统中的MrpD和MrpF两种蛋白作为疏水蛋白标记结合到目标蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)，大肠杆菌酸性磷酸酶(EcAP)或碱性磷酸酶(PhoA)，麦芽糖结合蛋白(MBP)等的末端。经研究结果表明，大多数整合蛋白的跨膜结构域作为疏水标记可以起到将目标蛋白锚定在生物体体细胞膜上的作用。在此基础上，本课题进一步研究带有该疏水标记的重组目标蛋白与材料表面的相互作用。一方面选用大肠杆菌酸性磷酸酶(EcAP)和大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)作为目标蛋白模型，选用枯草芽孢杆菌MrpD全蛋白和M

3、rpF的跨膜结构域作为疏水蛋白标记构建融合蛋白。另一方面，选用以MPEG(750)．SH改性后金片表面作为相互作用的材料模型。金片表面本身可与疏水标记进行相互作用，同时，MPEG(750)．SH可以排斥非特异性蛋白吸附，对目标蛋白酶活性的保持也可以起到一定的作用。结果表明，目标蛋白酶通过该疏水标记可以成功锚定在金片表面，同时，在一定程度上保持其活性。而不含疏水标记的蛋白则会被洗脱掉，从而达到分离蛋白的目的。该研究为蛋白分离纯化技术提供了一种新的方法和思路。关键词：蛋白分离，整合蛋白，金片表面AbstractProteinseparationandpurificationtechnologypl

4、aysanimportantroleinpromotingthedevelopmentofgeneticengineering，molecularbiology,immunology,diseasediagnostics，andmanyotheremergingdisciplines．Thedevelopmentoflifesciencesandbiotechnologyrequiresmoreefficientmethodsandstrategiesforseparationandpurificationofbiologicalmacromolecules．Proteinsoftenexis

5、tinacomplicatedsystemandaresensitivetoenvironmentalfacetssuchastemperature，pH，mechanicalshearstress，andSOon．Thus，mosttraditionaltechniquesforseparationofsmallmoleculesCannotbedirectlyappliedinproteins．Inthepresentstudy,weexploredanovalmethodbasedontheinteractionofIntegralmembraneproteins(IMPs)andthe

6、hydrophobiesurfaceofamaterialtoisolateandseparateatargetprotein．IMPspossessoveronequarterofthetotalproteinsofvariousorganisms．TheseIMPsareembeddedinthelipidmembranewhichisessentialtomaintainthehydrophobicstructureandfunctionofIMPs．Uptodate，mostapplicationsofIMPsarerelatedtotheirphysiologicalroles．Ho

7、wever，thehydrophobicstructureofIMPscanalsobeutilizedformulti．purposeresearch．Inthisstudy,weinvestigatedthepossibilityofusingtrans．membranedomainsofIMPsforanchoringproteinsinvivoandexvivo．Severaltrans．