紫杉醇含量测定

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1、微球载药率和包埋率的测定紫杉醇的定量分析采用高效液相色谱法。色谱柱采用Inersil®ODS-3C18柱，流动相为乙腈/水（60/40），流速为1mL/min，进样量为100μL，紫外检测波长为227nm。采用紫杉醇标准品绘制标准曲线：精密称取紫杉醇标准品10mg，溶于100mL的乙腈/水混合溶液（60/40）中，配制成100μg/mL紫杉醇储备液，精密量取5、4、3、2、1、0.5和0.25mL储备液于5mL容量瓶中定容，分别得到浓度为100、80、60、40、20、10和5μg/mL的标准液，采用上述液相色谱条件进行测定得标准曲线。微球中的紫杉醇含量的测定：精确称取10mg载药微球溶

2、于5mL乙腈中，每个样品做3个平行样，长时间超声后，置室温下过夜降解，漩涡3min，8000rpm下离心5min后取上清液600μL，加400μL超纯水完全混匀，使乙腈与水的体积比为60/40，采用上述色谱条件进行HPLC测定，将测定的峰面积代入标准曲线即可求得样品中紫杉醇浓度，进而计算得到微球的载药率（LoadingEfficency，LE）和包埋率（EncapsalutionEfficency，EE）。载药微球体外释放行为测定精密称取5mg载药微球置于8mL玻璃小瓶中，加入5mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4，其中含0.1%吐温80和0.1%吐温20）。释放实验每个样品做三个平

3、行样。将其置于37℃恒温空气浴振荡器中振摇释放药物，振摇频率为40rpm。特定时间段，将样品取出在8000rpm下离心5min。将微球用新的磷酸盐缓冲液重新悬浮进行进一步的药物释放，上清液中加入2mL二氯甲烷溶液对PTX进行过夜萃取，当二氯甲烷溶液挥发干燥后加入1mL乙腈/水溶液（60/40）溶解紫杉醇，用上述HPLC方法测定释放的药物量。2.2.1检测波长的选择紫杉醇适量,加甲醇溶解,制成每1ml中约含10陀的溶液。以甲醇为空白对照,按紫外分光光度法在200nln一400nln波长范围内进行紫外波长扫描。2.2.2色谱条件色谱条件:Diamonsile18柱;流动相为甲醇:乙睛:水(4

4、0:35:25,v/v加);流速1.0ml/min;柱温30℃;检测波长为227nm;进样量20μl。2.2.3标准曲线的制备以紫杉醇原料药为对照品,精密称取适量,以甲醇溶解制备对照品储备液,用流动相稀释配制成浓度分别为0.101、0.202、0.404、0.808、1.01、2.02、5.06、10.12、20.24μg/ml系列标准溶液。准确吸取不同浓度的标准溶液20μl进样,以紫杉醇质量浓度(C)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线。2.9TAX一NPs体外释药特征考察选取不同pH(5.5、7.4)的IM水杨酸钠的磷酸缓冲溶液(PBS)作为释放介质,考察载药纳米粒在不同pH

5、环境下的释放特征。将载药纳米粒置于不同的释放介质中,制成1mg/ml的聚合物胶体溶液,精密移取1.0ml上述载药纳米粒于透析袋(MYVCO=7000Da)中,然后将密封的透析袋置于10ml的释放介质中,每组平行3个样品,在37℃,100次/min振荡的条件下进行体外释放实验。于一定时间内取出全部释放介质,并补充等量体积的新鲜介质。释放介质中的紫杉醇用二氯甲烷萃取2次,每次lml,合并有机相,氮气吹干,加入流动相溶解,用HPLC法测定样品中紫杉醇的含量,计算药物的累积释放量和累积释药百分率。同法对紫杉醇原料药的释放行为进行研究以作对比。所用色谱条件同2.22项”。2.7.5差示扫描量热法(

6、DSC)分析以空铝钳锅为参比物,另一铝锅中分别放入样品TAX、PLGA~NP、TAX~PLGA~NP、PLGA一NP+TAX进行测试,升温速度为10℃/min,扫描范围在40~250℃,氮气流为50ml/mln,分别绘制样品的DSC曲线图[s]。3.4.4差示扫描量热法(DSC)分析热量曲线如图2.8所示,从图中可以看出,1显示TAX在223℃处出现熔融吸热峰,此峰在TAX与PLGA~NP的物理混合物2中也明显可见,但相对较弱,而载药纳米粒中这些峰基本消失,因此可说明被纳米粒包裹的药物为无定形或半晶形结构。这与XRD分析结果一致。2.8IAX一NPs体外稳定性考察将冻干的TAX.NPs密

7、封于小瓶中,与4℃冰箱放置一定时间,测定纳米粒的粒径、Zeta电位与包封率。