新生小鼠nk细胞对mφ细胞调控不足致胆道闭锁机理地研究

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1、AdissertationsubmittedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnologyfortheDegreeofDoctorofMedicineTheinvestigationofmechanismforinadequateregulationofhepaticNKcellsonMφcellsinduceingbiliaryatresiainnewbornmiceD.Candidate:PengFeiMajor:PediatricSurgerySupervisor:Prof.FengJiexiongHuazhongUniversity

2、ofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaMay,2014万方数据独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被

3、查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日万方数据目录前言1摘要9Abstract14英文缩略词表20第一部分RRV感染不同年龄小鼠后，肝脏NK细胞活化的差异22前言22主要实验材料22实验方法25结果30讨论30参考文献31附图33第二部分新生小鼠Kupffer细胞分离培养及吞噬活性测定。36前言36主要实验材料36实验方法38结果4

4、1讨论42参考文献43附图45第三部分依赖于IL-4、IFN-γ，不同年龄小鼠肝脏NK对Mφ细胞调控的差异。51前言51主要实验材料51实验方法54结果67万方数据讨论67参考文献69附图78第四部分不同年龄小鼠肝脏NK细胞对吞噬RRV的Mφ细胞杀伤的差异前言79主要实验材料79实验方法82结果90讨论90参考文献91附图93总结97综述98参考文献106附录115致谢116万方数据华中科技大学博士学位论文新生小鼠NK细胞对Mφ细胞调控不足致胆道闭锁的机理研究前言胆道闭锁（biliaryatresia,BA）是一种肝内外胆管进行性闭塞性病变，该病进展[1,2]迅速，很快发生肝纤

5、维化，如不进行有效治疗，患儿将在1岁左右死亡。目前病因不明，国内外对BA患儿肝内外胆管损伤机理进行了大量研究，提出可能因素有：先天性发育异常、围生期病毒感染、免疫反应异常、微嵌合体、以及环境毒素等，其中免疫反应异常在BA胆管损伤中可能起着非常重要作用，而病毒感染则可能是引起免疫损伤的直接原因。研究发现，BA患儿胆管上皮细胞的坏死与肝内外胆管组织周围的单核细胞[3]（CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Kupffer细胞）浸润有关。BA肝脏组织中与[4]Th1类炎症反应相关的基因（如IL-12、TNF-a、IFN-y等）均表达上调。另有研究发现，炎症因子IL-18在BA患儿中

6、有增加，且其增加程度与肝脏损伤、术后黄疸持[5]续存在、门脉高压和预后均有关。我们和国外的研究均发现，肝内胆管HLA-DR高表[6]达与预后呈负相关。我们以前的实验还表明NF-κB的活化可诱导NO的产生，继而[7,8]损伤肝内胆管，而OPN在BA肝纤维化过程中起重要作用。同时，宫内感染和围生[9]期病毒感染与BA的关系已获人体和动物实验所证实。BA和新生儿肝炎患儿均具有很高的巨细胞病毒感染检出率，因此很多年来巨细胞病毒均被认为是引起BA的可能[10]病原体。我们最近的研究发现BA患儿巨细胞病毒的感染率为57.1%，略高于国外相关报道。有人在18例BA患儿中发现10例有恒河猴轮状

7、病毒（RhesusMonkeysRotavirus，RRV）感染，而且还发现BA患儿血中RRV特异性抗体较正常新生儿升高4倍以上。给孕鼠口服RRV，可在新生小鼠肝脏中检测到RRV并观察到肝内、外胆管损1万方数据华中科技大学博士学位论文伤。德国学者Petersen等人给新生小鼠腹腔注射RRV，可在75%左右的新生小鼠中观察到与人类BA完全一致的肝内外胆管进行性损伤，已成为研究BA发病机理的标准动[11]物模型。目前国内外的研究发现，IFN-y、CD8+T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞（macro