双荧光标记生物芯片激光共聚焦检测系统-光学精密工程

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1、第１３卷第６期光学精密工程Ｖｏｌ．１３Ｎｏ．６２００５年１２月ＯｐｔｉｃｓａｎｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＤｅｃ．２００５文章编号１００４９２４Ｘ（２００５）０６０７２７０８双荧光标记生物芯片激光共聚焦检测系统马军山，侯琳琳，付东翔，陈家璧，庄松林（上海理工大学光学与电子信息工程学院，上海２０００９３）摘要：基于激光共聚焦检测原理，构建了针对荧光标记生物芯片的检测系统，对用Ｃｙ３或Ｃｙ５标记蛋白点样的玻片进行了扫描检测，并对采集的荧光数据信号进行了图像重建。针对实际荧光信号可能较微弱并存在较大动态范围的情况，采用形态

2、学方法对图像进行滤波、增强处理，显著增强了图像质量。提出了标定系统信噪比和灵敏度的公式，并据此对检测实验结果进行了详细的分析计算，最终标定此激光共聚焦生物芯片检测系统的灵敏度约为０．１ｆｌｕｏ／２。μｍ关键词：生物芯片；共聚焦系统；双荧光；形态学；灵敏度中图分类号：ＴＮ２４７文献标识码：Ａ犜狑狅犾犪狊犲狉狊犮犪狀狀犻狀犵犮狅狀犳狅犮犪犾狊狔狊狋犲犿犳狅狉犿犻犮狉狅犪狉狉犪狔犪狀犪犾狔狊犻狊ＭＡＪｕｎｓｈａｎ，ＨＯＵＬｉｎｌｉｎ，ＦＵＤｏｎｇｘｉａｎｇ，ＣＨＥＮＪｉａｂｉ，ＺＨＵＡＮＧＳｏｎｇｌｉｎ（犗狆狋犻犮狊犪狀犱犈犾犲犮

3、狋狉狅狀犻犮狊犐狀犳狅狉犿犪狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犛犺犪狀犵犺犪犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犛犺犪狀犵犺犪犻２０００９３，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｄｕａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｃａｎｎｅｒｂａｓｅｄｏｎｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅＣｙ３ｐｒｏｔｅｉｎｏｒＣｙ５ｐｒｏｔｅｉｎｄｏｔｔｅｄｓｌｉｄｅｓ．Ｔｈｅｉｍａｇｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓ

4、ｃｅｎｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙｓｉｇｎａｌｓ，ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｄｏｐｔｉｎｇｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｍｅｔｈｏｄｓｔｏｍｅｅｔｔｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙｗａｓｖｅｒｙｌｏｗａｎｄｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｄａｔａｗａｓｗｉｄｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｍｅａｓｕｒｉｎｇｗａｙｓｏｆｔｈｅｓｉｇｎａｌｔｏｎｏｉｓｅｒａｔｉｏａｎｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｓｙｓｔｅｍ２ｗｅｒｅｐｕｔｆｏｒｗａｒｄ，ａｎｄｔ

5、ｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｓｙｓｔｅｍｉｓａｂｏｕｔ０．１ｆｌｕｏ／μｍ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｂｉｏｃｈｉｐ；ｃｏｎｆｏｃａｌｓｙｓｔｅｍ；ｄｕａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ较低。若要提高横向分辨力，需要提高成像系统１引言的放大倍数，相应视场将减小（即一次测量的芯片面积较小），当需要测量的芯片面积较大时，只能生物芯片在新药开发、疾病诊断及基因表达多次分块测量后再拼接。由于分块扫描实际上是［１］分析等方面具有广泛的应用。目前主要的检测通

6、过机械运动方式使芯片与成像系统做相对运原理和结构分为ＣＣＤ扫描和激光共聚焦扫描。动，故机械定位误差将形成扫描图像的拼接误差，ＣＣＤ扫描系统相对于激光共聚焦扫描系统所以这种方法不适用于高精度的高密度生物芯片来说，结构较简单，检测速度较快，但横向分辨率检测。另一方面，ＣＣＤ灵敏度远低于光电倍增收稿日期：２００５０６２２；修订日期：２００５０８１８．基金项目：上海市科委科技发展基金资助（Ｎｏ．０２２２６１０１６）。７２８光学精密工程第１３卷管，因此系统检测灵敏度也较低。基于激光共聚焦原理构建的生物芯片检测系统对生物芯片进行逐点扫描，由

7、于生物芯片始终处于焦平面，因此激发光的光斑尺寸非常小，横向分辨率较高。检测光路通过在接收端设置一共轭针孔，可以消除焦平面以外杂散光的干扰，检测灵敏度也较高。由于激光共聚焦检测方式具有高分辨率和高灵敏度的特点，能够获得生物芯片上用荧光标记的抗体等的清晰数字荧光图像和定量分图１实际实验系统照片析结果，故已成为高密度生物芯片扫描所主要采［２］Ｆｉｇ．１Ｐｈｏｔｏｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｙｓｔｅｍ用的检测方法。在实际应用中，不同的探针需要采用相应的荧光物质标记，目前使用广泛的荧光标记主要为Ｃｙ３和Ｃｙ５荧光染料，它们的激发光波

8、长以及受激产生的荧光波长各异，因此检测仪器应能对不同荧光物质进行激发，并分别检测相应的荧光信号。本文描述了可对Ｃｙ与Ｃｙ荧光物质进行检３５测的双荧光激光共聚焦生物芯片检测系统，并进行了相关的实验研究，运用形