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1、第%%卷第!"期"’’(年!"月物理学报TH:,%%，EH,!"，5@B@1<@I，"’’(!’’’7#"+’N"’’(N%（%!"）N("&!7’(OCPO3FQRSCORSESCO!"’’(C;90,3;L/,RHB,"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""双光子激发时间分辨荧光光谱测量技术!!）"）#）!）!）!）!）!）!）!）$刘立新屈军乐林子扬陈丹妮许改霞胡涛郭宝平牛憨笨!）（深圳大学光电子学研究所，
2、深圳%!&’(’）"）（中国科学院西安光学精密机械研究所，西安)!’’(&）#）（中国科学院研究生院，北京!’’’*+）（"’’%年!!月""日收到；"’’(年(月&日收到修改稿）建立了一台基于高重复频率扫描相机的双光子激发时间分辨荧光光谱测量系统，能够同时测量样品的荧光光谱和寿命,该系统的时间分辨率为(-%—"’’./，光谱分辨率为!—#01，能够实现快速数据采集以及可靠和可重复的寿命和光谱测量,利用标准荧光染料（若丹明(2、香豆素#!*）及其混合溶液对该系统进行了测试，所得到的荧光光谱分布和寿
3、命值与文献报道一致,实验结果表明，该系统能有效区分多组分荧光团,这为鉴别多荧光团或多组分生物组织提供了一种独特的对比方法，可用于多光谱分辨荧光寿命成像和荧光共振能量转移成像等方面,关键词：荧光寿命，荧光光谱，双光子激发，高重复频率扫描相机!"##：’)(’3，’)(%，#%&’4，##%’5［!%，!(］越来越重要,荧光光谱和寿命测量相结合为解!-引言决多组分问题提供了有效手段，引起了生物医学领域的广泛关注,多光谱分辨荧光寿命成像显微术荧光光谱技术已经发展成为生物医学领域的强（G:=HI@/B@0
4、B@:9G@J91@918K90K19BIH/BH.L）已经发展了［!，"］大工具,为了提高诊断的灵敏度和特异性，人们多种方法：可以由多色仪和时间相关单光子计数总是希望获得尽可能多的特征参数,荧光寿命测量（J91@7BHII@:8J@A/90K:@7.;HJH0BH=0J90K）成像模块结［!)，!&］为光谱测量提供了互补的功能信息，可以对荧光分合，也可以由门控图像增强器（K8J@A918K@"DD［!+］、成像摄谱仪［"’］子所处微环境（C8，E8等离子浓度及.F值、氧90J@0/9G9@I）与
5、色散元件（如双色镜［#］压等生理生化参数）进行定量测量，而且对于鉴别等）结合来实现,扫描相机（/JI@8MB81@I8）是获取时光谱严重重叠的多荧光团非常有用,采用双光子激间分辨荧光光谱的另外一种方法，与时间相关单光发（近红外：)’’—!’’’01）能够显著提高样品的荧子计数法或门控图像增强器方法相比，扫描相机能光成像深度和空间分辨率，减少对活体样品的损伤，以高时间分辨、高速度和高灵敏度同时获得光脉冲［*，%］提供更高的图像信噪比，而且一个波长能够同时的一维空间和时间结构信息，当它与分光元件相结激
6、发具有不同吸收光谱的多种荧光团,因此，双光合，就能够只用一个探测器同时获取发射信号的时［"!，""］子激发时间分辨荧光光谱测量能够为生物医学检测间和光谱信息,和分析提供高时空分辨率的互补功能信息，并有望本文建立了一台基于高重复频率扫描相机的［(］［)］在蛋白质间相互作用的研究、癌症的早期诊断双光子激发时间分辨荧光光谱测量系统,用标准［&，+］和组织鉴别等生物学和临床医学领域获得重要荧光染料（若丹明(2、香豆素#!*）及其混合溶液的应用,对该系统进行了测试,实验结果表明，该系统能够［!’，!!］近年
7、来，随着高速探测技术以及量子点、荧采用光谱分辨和简单的单组分数据拟合的方法，［!"］光蛋白等新型荧光探针的不断发展，荧光技术越有效区分双组分荧光团,因此它提供了一种解决来越多地应用到生物物理、生物化学以及生物医学复杂的多荧光团或多组分问题的简单而有效的［!#，!*］等领域，解决样品中多组分荧光的问题也变得途径,!国家自然科学基金（批准号：(’!#&’!’，(’*’&’!!）和广东省自然科学基金（批准号：%’!’%’’）资助的课题,$67189:：;<09=>/?=,@A=,B0*!1!物理学报DD
8、卷内的重复频率下工作，扫描电路的触发晃动与触发［!’］!"实验系统信号的重复频率及幅度的稳定性有关&另外，为了满足不同荧光染料以及生物组织对荧光寿命测量双光子激发时间分辨荧光光谱测量系统主要由范围的不同要求，该相机的扫描量程分为%，*，%!和钛宝石飞秒激光器、脉冲提取器、荧光显微物镜、棱*-2/四档&镜分光光谱头、自行研制的高重复频率皮秒扫描相机、光锥耦合的电荷耦合器件（##$）实时读出系统’"实验结果及讨论和计算机等组成，如图%所示&实验中采用的激光器输出波长为1--23，脉冲宽
