时间分辨荧光技术复习进程.ppt

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1、时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫技术背景1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理论，1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高（10-18mol/L)，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段2时间分辨荧光免疫技术的应用在药物含量测定中的应用有研究者建立了环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法，该方法具有灵敏度高、特异性好、性能稳定的优点，适于高通量筛查。张祯等基于竞争双标记时间分辨荧光

2、免疫分析技术，建立了一种新的同时测定猪肉组织中氯霉素和莱克多巴胺的方法。利用两种不同标记的抗体同时检测属于不同种类的药物残留。蛋自质定量分析细胞因子测定方面TRFIA逐渐开始取代RIA、酶联免疫分析(EIA)法。如测定CEA、甲胎蛋白、肿瘤相关抗原等。激素免疫测定TRFIA已取代RIA、EIA等方法，检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等多方面。3酶活性的检测Gabou等用TRFIA技术测量了端粒酶活性。Kavrinen等利用多标记时间分辨碎灭分析技术实现了对aspase家族多参数活性检测。微生物诊断由于TRFIA灵敏度

3、高，目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。基因分析铕标记的链霉亲和素-生物素探针，使核酸杂交整个过程变得快速、简单。目前，稀土元素标记探针技术已用于检测HIv、前列腺特异性抗原mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA和HLA．27等位基因，获得了满意的结果。Nurim等使用斓系离子鳌合物标记等位基因特异探针来筛选新的基因标志。4时间分辨荧光免疫技术简介时间分辨免疫荧光技术的定义用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素

4、、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质。当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。5所需试剂和仪器试剂：1.固定相（96孔板）2.固相的抗原或抗体（待测物）3.标记物：镧系元素离子及其螯合物(铕(Eu)钐(Sm)镝(Dy)、锝(Tb));4.螯合剂、增强液仪器：时间分辨系统(全自动时间分辨免疫荧光分析系统-1235Auto300×192)6T

5、RF分析原理图7TRFIA反应模式TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法。竞争法又有两种：(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体；(2)固体抗原和游离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞争法多用于检测小分子半抗原。无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子的抗体-抗原免疫复合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螫合剂必须一端与镧系稀土离子结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发

6、产生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应。此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍。8加样本微量反应孔包被好的抗体9振荡、洗板待测项目（抗原）10加入Eu标V11VEu标记物轻链螯合剂Eu重链12振荡、洗板V13加入解离增强液HHHHHHHHHHHHHH14H15仪器检测16标记物为稀土金属---镧系元素铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb)镧系元素荧光特点：1、荧光寿命极长镧

7、系元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100us样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭2、Stokes位移大（大约290nm）有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。铕：激发光340nm、发射光613nm荧光素的Stokes位移为280nm3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615±5nm）4、解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍17利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为018巨大Stokes位移发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移

8、。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离19时间分辨荧光免疫---突出优点特异性荧光与非特异性荧光分