时间分辨荧光分析技术

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1、时间分辨荧光分析技术1.1时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以來［1］,已广泛的应用丁•免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA朵交测左法、时间分辨荧光显微镜成像测圧法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。1.1

2、.1稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB族的锄系元素以及铳和轮，共17种元素。其中鋼系元索的外层电子结构为4f0-145d0-106s1-2,由于5s和5p电子对4f电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图［2］。3530ENERGY,103cm-l25205D1D349/2G5/2DO1510513/2H9/2F2F0m3s/2H5三—寸1■1i==-Eg寸E57F66Hl5/2Eu3+Tb3+Dy3+图1.1部分三价稀土离子的电子能级图Fig.1.1

3、Electronicenergylevelsofcertainlanthanide（III）ions人部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显箸增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]o以钳（III）配合物为例，其荧光发光机理如图1.2所示[9],包括三线态发光机理和单线态发光机理。当馆仃TD配合物受光激发后，配体分子吸收激发光能量由基态SO跃

4、迁至第一单线激发态S1,处于此激发态的分了不稳定，可以通过辐射跃迁的方式返凹基态，发出配体荧光（S1-S0），也可以通过系间窜跃（非辐射跃迁方式）将能量传递至配体的第一三线激发态T1。处于T1能级的配体分子可以通过辐射跃迁的方式回到基态，发出配体磷光（T1-S0）:当T1能级高于Eu3+的共振能级时，能量就可以进一步传递给Eu3+使Z激发至共振能级,并在由共振能级跃迁冋基态的过程屮发II!Eu3+的特征荧光，此即三线态发光机理。而上述处于S1激发态的配体分了如果不经过T1激发态，直接将能量传递给Eu3+使Z激发至共振能级，然后由共振能级跃迁回基态发出

5、Eu3+的特征荧光,此即单线态发光机理。到目前为止,绝大多数的Eu3+配合物的荧光发光都遵循三线态发光机理，只有极个别的遵循单线态发光机理。SD321DDDDO1DOFF620F6F2F0SlheriTiiLldecay•xm二-Lr上二ligandEu3+S7FEu3+(a)(b)图1.2钳(III)配合物发光机理示意图：(a)三线态发光机理；(b)单线态发光机理Fig.1.2SchematicdiagramsoftheradiativeprocessesofthechelateleadingtoEu3+fluorescenceby(a)tripl

6、etexcitedstatemechanismand(b)singletexcitedstatemechanism不同于有机荧光化合物，稀十•配合物的荧光性质，一方面取决于有机配位体的三重态能级T1的位置，另一方面取决于配位体与稀土离子处于激发态时的能量匹配程度。荧光发光的波长和强度,均随稀土离子的不同而不同。Sm3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+等稀土离子的配合物属于钏系元素荧光配合物中的强荧光物质。激发这些离子所需能量较低，同时由于这些离子的激发态和基态能量相差较大，非放射迁移较小，因此它们的荧光量子产率相对较高。由于稀土荧光配合物特殊的发光机理

7、，使其相对于常规有机荧光化合物，像荧光素和罗丹明等而言具有以下特点：（1）荧光发射的特征峰波长主要与屮心离子有关，而与配位体结构关联不大。稀土配合物发光是基于配合物内曲配位体到中心金属离子的能量转移所产生的，配位体吸收激发光能量后转移到中心稀土离子，然后再通过中心稀土离子的4f轨道能量跃迁而发岀荧光，即接受激发光能量和发射荧光是由不同的部分所完成的，因此同一种稀土离子与不同配位体形成的配合物的荧光发射峰波长基本不变。（2）荧光寿命非常长,通常在10us（Sm3+、Dy3+）或100us（Eu3+、Tb3+）以上。这是由于稀土配合物的发光是经过配位体的

8、三重态的能量转移所致，所产生的荧光是延迟荧光，其寿命比配位体的磷光寿命述要长。从表1.1对以看出，Eu3+配