产酯酶海洋细菌的选育与菌株eb2的发酵条件及酶学性质研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文产酯酶海洋细菌的选育与菌株EB一2的发酵条件及酶学性质的研究摘要微生物酯酶作为重要的工业用酶，广泛地应用于食品、化工、医药、环保及军事等领域。本论文对产酯酶海洋细菌进行了筛选和鉴定，复合诱变选育，产酶发酵条件以及酶学性质的研究。根据酯酶的基本作用特性和机理，在初筛和复筛中添加适当的底物和指示剂，对产酯酶海洋细菌进行大量的筛选试验，同时建立了一种简便有效的筛选模型，并从中筛选出一株产酯酶菌株EB．1，产酶活力达22．8U／Il儿。通过对菌株EB．1的形态特征、培养特征、生理生化特征以及16SrI斟A分子分类鉴

2、定相结合的方法，最终将该菌株鉴定为觑f盯淞s材6f胁var．丹劫弦，．：菌体大小约为(O．6～O．7)岬×(1．5～2．5)岬；革兰氏染色阳性菌；呈杆状，圆端，单个或短链状排列；14h后有单芽孢生成，不使菌体明显膨大；菌落初期为乳白色，表面光滑、粘稠；24h后呈乳黄色，表面干燥；48h后随时间的延长有大量的黑色素产生等。菌株EB．1的各项生理生化特征基本与陆源肋c讲淞J甜6舭相同，但也有一些其特有的性质，如能同化甘油、耐中盐以及能在O℃生长等。为了使菌株EB．1适应发酵生产的需求，对其进行了原生质体紫外线复合诱变。在原生质体形成和

3、再生的最佳条件下制备到的原生质体，经过紫外线诱变后，对再生突变菌株进行大量筛选，最终获得产酶稳定的菌株EB．2，其产酶活力达到77．6U／IIlL，比出发菌株提高3．4倍，从而解决了该菌株规模化生产上的局限性。另外，为了更好地提高产酯酶菌株EB．2发酵产酶水平，本文对其发酵条件进行了研究。通过单因子和正交试验对碳源、氮源、无机盐、诱导剂、培养时间、起始pH值、接种量和接种龄等发酵条件的研究，最终确定了菌株EB．2的最佳发酵培养基为：蔗糖15．O∥L、蛋白胨10．0∥L、牛肉膏7．5g／L、K2肿04O．5g／L和花生油5．OmUL

4、，此时的产酶水平达到了815．40U／InL，比起始条件提高10．5倍；最佳产酶条件为：以种龄16h、6％的接种量、10％的装液量装入250mL三角瓶中，35℃、220r／miIl培养22h，最终使菌株的产酶水平达到了970．33U／InL，总体提高12．5倍。对初步纯化到的酯酶的酶学性质进行了研究，其最适pH为10．0，最适温度上海海洋大学硕士学位论文为60℃，pH稳定范围为8．O～11．0，热稳定范围为35℃～60℃；经过SDS．PAGE凝胶电泳和RotoforCeU等电聚焦仪分别测得其分子量为30．0kDa、pI为4．5；金

5、属离子中ca2+、M92+、Li+、2rn2+为酯酶的激活剂，Ba2+、Fe3+、Ag+、sP为其抑制剂；酸根离子中Bf、N03‘、P04孓等可以增大酯酶活性；与常见化学试剂的配伍性较差，受到EDTA的抑制作用严重；在有机溶剂中，受到丙酮、乙醚、石油醚的激活，但是受到正己烷、异辛烷、氯仿的抑制；其最适底物为甜乙酸萘酯，其次为硝基苯磷酸二钠盐和三丁酸甘油酯。该酯酶是一种新型的碱性耐热酯酶，具有较高的耐碱性和热稳定性，为其工业化生产提供了便捷，同时也拓展了其在各个领域的应用范围。本论文的实验结果具有一定的创新性，填补了国内在微生物酯酶

6、研究领域的一些空白，对加速开发我国海洋微生物资源的利用及其产业化具有重要的理论和实际意义。关键词海洋细菌，酯酶，鉴定，诱变育种，发酵条件，酶学性质Ⅱ上海海洋大学硕士学位论文SelectionandBreedingofEsterase—producingMarineBacteria，FermentationandSomePropertiesofEsteraseABSTRACTMicrobialester嬲ehasbeenappliedint11efieldsoffood，cheIIlicaliIldus仃y’medicinc，env

7、ironmentandmilita】眵析．ai孤Thestudiesmaildyfocu∞d0nthcscre砌ng钺ldidemificatio玛conl】positcmmagenesis，fe加∞mationconditio鹏趾dpropeniesofem了me．B嬲edontlle缸以amentalprincipleandspeciali锣ofⅡlcIIlicrobiaJesterase，proper蹦lbs仃atesandilldicatorswercusedt0screen廿leesterasc—pfoduciIlgma

8、rimbact耐aiIlthepreliIllina巧锄d∞conda巧screellillg．AprcciseandrapidscreeIliI培metllodw硒developed．OncSn试nEB-l，砌Ch、Ⅳ嬲isolatI喜d舶mre