SNT2666-2010-苜蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６６６—２０１０苜蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狊犻狊狊狌犫狊狆．犻狀狊犻犱犻狅狊狌狊（犕犮犆狌犾犾狅犮犺）犇犪狏犻狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２６６６—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并

2、归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张乐、张祥林、赵文军、王罛、高文娜、丁翠珍。Ⅰ犛犖／犜２６６６—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售苜蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法１范围本标准规定了苜蓿细菌性萎蔫病菌［犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．犐狀狊犻犱犻狅狊狌狊（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ）Ｄａｖｉｓ］的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境苜蓿种子及其产品中苜蓿细菌性萎蔫病菌的检疫和鉴定

3、。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１５３８．１培养基制备指南第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１８０９进出境植物种子检疫规程３原理苜蓿细菌性萎蔫病菌的分类地位属于厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、厚壁菌纲（ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａ）、真细菌目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、棒形杆菌属

4、（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉）。该病菌的生物学特性（参见附录Ａ）、血清学特性和分子生物学特性是制定本标准的主要依据。４仪器设备和用具４．１仪器设备电子天平（感量１／１００００ｇ）、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机、低速离心机、纯水器、恒温水浴锅、低温冰箱、酶标仪、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌机等。４．２用具培养皿、试管、可调式微量进样器（２、１０、２０、１００、２００、１０００）及其枪头、研钵、μＬμＬμＬμＬμＬμＬ

5、９６孔酶联反应板、离心管（１．５ｍＬ、１０ｍＬ）、ＰＣＲ管（０．２ｍＬ）、量筒、烧杯。５试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。培养、鉴定苜蓿细菌性萎蔫病菌所用的试剂见附录Ｂ、附录Ｃ并参见附录Ｄ。１犛犖／犜２６６６—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售６检疫鉴定方法６．１常规生物学检测６．１．１田间调查及植株检验苜蓿细菌性萎蔫病在田间的典型症状是植株矮化、丛生，叶变小、褪绿，根部维管束组织变褐色。田间调查时采集具可疑症状的植株根、茎带回实验室

6、，用清水冲净，晾干后用干净剪刀剪成１ｃｍ左右的小段，无菌操作下，将各样品用有效氯１％的次氯酸钠做表面消毒１ｍｉｎ～３ｍｉｎ（视材料粗细而定），无菌水清洗３次后，置于无菌空培养皿中，加少量无菌水，用灭菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在改良Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ琼脂培养基（含２５０×１０－６的放线菌酮）平皿上划线分离，２０℃恒温培养５ｄ～７ｄ，观察菌落生长情况。６．１．２种子检验依据ＳＮ／Ｔ１８０９的规定随机抽取２５ｇ苜蓿种子（约１００００粒）为一份样品，用电动搅拌机将种子样品打碎，然后悬浮于２５

7、０ｍＬ无菌水中，４℃冰箱过夜；室温下在振荡器上以２５０ｒ／ｍｉｎ振荡３０ｍｉｎ，用ＭＮ６０６１／４滤纸过滤。每毫升滤液中加０．１ｍＬ３７％（质量浓度）甲醛溶液，室温孵育１ｈ。然后以７０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，重新悬浮于２ｍＬ蒸馏水中。将其均分为３份，其中１份做分离培养检验，另２份加１０％甘油保存，分别用做ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ检测实验。将上述菌悬液经倍比稀释（１０－１－５）后，取每个稀释度０．１ｍＬ在改良Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ琼脂培养基～１０平板上分离，重复２次～３次，在２０℃～２２℃培养５ｄ

8、～７ｄ，观察菌落特征。典型菌落特征同６．１。６．１．３病原菌的生理生化鉴定将供试菌株悬浮于５０蒸馏水，在金氏Ｂ培养基平板上划线，２０℃～２２℃培养５ｄ～μＬ～１００μＬ７ｄ，观察菌落形态及色素产生情况，然后进行下列生理生化测试，苜蓿萎蔫病菌在金氏Ｂ培养基形成淡黄色、圆形，边缘光滑，有光泽，无荧光的菌落，能产生颗粒状蓝黑色色素。其生理生化特性具体参见表Ａ．１。６．２双抗体夹心酶联免疫吸附法检测见附录Ｃ。６．３犘犆犚法检测见附录Ｄ。７鉴定特征７．１常规生物学检测苜蓿细菌性萎蔫病菌在该培养基上可形成淡