基于核酸酶信号放大单碱基多态性的分析

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1、尘●，k卜JIIIIIIripIIrlllllIrIII＼1907534SNPsAssayBasedonNucleicAcidEnzymeSignalAmplificationbyYUZhaojiangB．S．(QingdaoAgriculturalUniversity)2008AthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMastorofScienceBiochemistryandMolecularBiologythe

2、GraduateSchoolofHunanUniversitySupervisorProfessorWangKeminProfessorYangRonghuaMay,2011』●-一I湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。⋯名孑引≥乙嗍加忙／月艺日学位论

3、文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密团。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：于剐；r≯刷磁辄历鼾慨11年6月2同11年6月2日0●-基于核酸酶信号放大单碱基多态性分析摘要核酸探针设计简单、稳定性好，具有高

4、选择性、高特异性及易合成修饰和信号机制转换灵活等优势，已被广泛应用于分析化学、生物医学、疾病诊断治疗与新药研发等方面。信号放大技术，尤其是利用工具酶结合其他分析检测手段的信号放大技术，由于其方法简单，灵敏度和特异性高，反应时间相对较短，近年来在核酸、蛋白质、重金属等物质痕量分析方面的得到了迅速发展。基于以上考虑，本文着眼于核酸探针灵活的信号转换机制和核酸酶的特异性，将核酸探针与核酸酶相结合，实现高灵敏、特异性核酸检测及单碱基多态性分析，包括如下两个方面的工作：(1)基于RNaseH的特异性作用和二氢卟吩Ce6

5、的光敏特性，发展了一种结合酶切和单线态氧双重信号放大单碱基多态性分析。当有完全互补DNA存在时，基于RNaseH的特异性作用实现循环放大，多次循环后，探针以单链形式存在并被吸附到单壁碳纳米管表面，二氢卟吩Ce6的光敏活性猝灭。当靶DNA和探针在RNA碱基处存在错配时，探针不能吸附到单壁碳纳米管表面，二氢卟吩Ce6促使单线态氧的持续产生。通过检测两种情况下溶液中单线态氧捕获剂SOSG的荧光差异实现了高灵敏、特异性单碱基多态性分析。该方法设计简单，灵敏度高，有望发展成为一种通用的单碱基多态性分析方法。(2)结合R

6、NaseH的特异性作用和G．四链体的过氧化物酶活性，发展了一种免标记放大单碱基多态性分析。当有完全互补序列存在时，与核酸探针形成双链结构，由于RNA碱基被特异性识别和切割，释放出目标序列，与下一个核酸探针分子结合。经过多次循环后，两段G．四链体的部分序列在溶液中相互远离，具有较弱的过氧化物酶活性。反之，当有单碱基错配序列存在时，RNaseH不能特异性识别和切割RNA碱基，具有较强的过氧化物酶活性。通过检测溶液吸收强度的不同实现了单碱基多态性的灵敏、特异性区分。该方法为单碱基多态性分析提供了一种免标记、放大检测

7、途径。关键词：核酸探针；RNaseH；单碱基多态性；信号放大；生物传感IIJ●■‘r◆’AbstractNucleicacidprobeshavebeenincreasinglyappliedinabroadrangeoffieldsinchemistry，biomedicine，diseasediagnosisandtreatmentduetotheirsimpledesign，goodstability，easysynthesis，andflexiblesignalmechanism．Inrecentye

8、ars，signalamplification，especiallyribozymecombinedwithotheranalysistechnologyofsignalamplificationtechnique，duetoitssimple，sensitivityandspecificity,andrelativelyshortresponsetime，havebeendevelopedrapi