黄颡鱼溃疡综合征病原菌与主要毒力因子研究

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1、摘要黄颡鱼溃疡综合征病原菌及主要毒力因子研究捅姜黄颡鱼(Peheobagrusmlvidraco，Yellowcatfish)属鲶形目，鳞科，黄颡鱼属。广泛分布于我国的长江、珠江、黑龙江流域及太平洋水系，是我国重要的淡水经济鱼类，也是我国出口创汇的优良鱼种，经济价值超过四大家鱼。在我国，黄颡鱼己人工驯化饲养，年产量已达50万吨左右，产值超过10亿元／年。由于养殖模式的变化和规模不断扩大，新的传染疾病出现了暴发与流行。近年来，重庆市一些集约化鱼场养殖的黄颡鱼出现鳍红肿、出血，肌肉溃疡及败血症的疾病，发病率超过30％，死亡率高达15％，经济损失巨大，严

2、重危及养鱼业的生存与发展。但是，该传染病的病原尚不清楚，故不能有效地进行预防和治疗。确定其病原及致病机理，可为有效预防和治疗黄颡鱼的溃疡综合征提供临床依据，对于黄颡鱼养殖有重要的理论和生产意义。目前，有关黄颡鱼溃疡综合征的病原尚不清楚，其致病机理也待研究。由于鱼类溃疡综合征的病原细菌有10余种，必须明确黄颡鱼溃疡综合征病原，弄清其发病机理，才能有效控制黄颡鱼溃疡综合征。本研究从患病黄颡鱼分离获得病原，借助细菌生化及分子鉴定方法确定病原种类，对溶血素、气溶素、胞外丝氨酸蛋白、脂肪酶重要毒力因子的基因进行了克隆，并通过大肠杆菌异源表达获得了重组溶血素，

3、为利用重组溶血素蛋白作为抗原，建立检测温和气单胞菌技术及亚单位疫苗研制提供了基础条件。主要研究结果如下：1．病原分离鉴定与致病性从黄颡鱼病料的心血获得两株细菌，命名为RC．07．KA株和IⅪ．07．XB株。两株细菌能够在LB、麦康凯、鲜血培养基上生长。生化试验鉴定两株细菌的氧化酶试验、精氨酸试验阳性、O／F发酵，l义’N生长试验、七叶苷、水杨苷等试验为阴性与温和气单胞菌(AsD6，_砌)生化特性一致；通过PCR扩增的16SrRNA基因序列与GenBallk上公布的25株细菌16SrIⅢA的基因序列进行同源性分析，结果显示，本次分离菌株与6株不同来源

4、的温和气单胞菌(4．sD6，妇)EU916710、DQ822702、DQ822759(LitbIlania，2008)，AY987762(IIldia，2006)，DQ、133178(Korea，2007)，EU069415(Cllina，2007)之间的亲缘关系很近，同源性达到96．4．99．8％。结合两种鉴定方法结果，证明分离的RC—07．KA株和RC．07．Ⅻ株为西南大学博士学位论文温和气单胞菌(彳．册6，切)。RC．07一KA株回归动物试验结果表明，RC一07．KA株对试验的黄颡鱼、鲤鱼、鲫鱼肌肉接种6．15×107CFU／尾，七天内能够导

5、致死亡。鲫鱼病理组织观察表明，肾脏肾小球肿大，肾小球毛细血管内皮细胞肿胀，肾小管上皮细胞肿胀，有的管腔内可见丝状纤维蛋白渗出，肾小管间质中可见炎性白细胞浸润；心脏部分心肌纤维肿胀，横纹不明显；肝脏肝细胞变性坏死，排列紊乱，中央静脉有纤维蛋白渗出，嗜中性白细胞浸润；肠道粘膜部分上皮脱落，肠内有大量中性白细胞和少量的巨噬细胞浸润等病变。表明RC．07．KA株对鲫鱼多器官有明显病理损伤。RC．07一KA株经LB液体培养基培养，过滤的无菌滤液，在10％鲜血LB琼脂平板上进行溶血活性初步测定，结果显示：无菌滤液的溶血效价达到l×25，表明RC．07．KA株具

6、有较强产生B溶血素特性；无菌滤液经硫酸铵二步盐析法处理得到胞外粗提物。溶血试验结果显示：胞外粗提物有明显的溶血性，表明具有溶血活性的D溶血素可以通过硫酸铵盐析方法制备。2．IⅪ．07．KA株主要毒力基因的克隆及序列分析温和气单胞菌的致病力与多种毒力因子相关，包括气溶素、溶血素、蛋白酶、脂肪酶等，为了探讨RC．07．KA株的毒力因子，本试验采用PCR方法，扩增、克隆了该菌株的溶血素、气溶素、脂肪酶和胞外丝氨酸蛋白酶基因，并对其基因序列进行了分析。2．1气溶素基因通过PCR扩增得到RC．07一KA株气溶素基因0．7kb片段，克隆到pGEM．T载体，测序

7、结果显示，所得到的基因片段大小为692bp，序列能编码230个氨基酸残基的多肽。Blast分析结果显示：得到的序列与气单胞菌属内菌株的气溶素基因相关，属于气单胞菌属的毒力因子气溶素超家族(aerolysinsuper‰ily)，序列含有成孔毒素的保守结构域序列；遗传进化分析结果显示：RC．07．KA株气溶素基因序列与中国、日本和印度等报道菌株么．砂咖叩办妇，AEF(HM853019，Cllina，2010)，彳．舳6，-砌，is01ateS2-As(AF443392，C11ina，2001)，彳．s06，砌isolateS34-As(AF44339

8、4，C11im，2001)，么．vP，D，2ff，S43一Av(AF443395，Cllina，2001)，彳．vP，D，