急性移植物抗宿主病状态下骨髓血管niche缺陷与其对造血干2f祖细胞的影响

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1、忽性移植物抗宿主条件-F&管niche的改变及对造血干／祖细胞的影响摘要异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcellstransplantation；allo．HSCT)是目前用于治疗良、恶性血液病、联合免疫缺陷病和某些自身免疫性疾病及一些实体肿瘤等疾病的重要手段。急性移植物抗宿主病(acutegraft—versus．hostdisease；aGVHD)是影响异基因造血干细胞移植成功最常见的并发症，其病理生理机制为植入的供体免疫活性细胞(T淋巴细胞)被宿主(受体)抗原致敏而激活、增殖、分化，直接或

2、间接导致靶器官的损害。aGVHD往往伴有造血功能障碍，影响患者生存。但目前aGVHD导致免疫造血功能障碍的机制尚不清楚。其机制有两种可能：一是aGVHD过程中产牛的细胞因子导致造血功能受抑，另一可能机制为骨髓微环境(niche)缺陷导致的HSC功能调控障碍。近年来的研究表明疾病状态下骨髓niche对HSC有显著影响。目前研究认为骨髓niche主要有两种，即骨内膜niche和血管niche，前者主要由位于骨内膜的成骨细胞所组成，后者主要由血管窦状隙内皮细胞(sinusoidalendothelialcells；SEC)和血管周围细胞组成。研

3、究发现血管niche在维持HSC池稳定和调控HSC自我更新能力等方面发挥重要作用。allo．HSCT后受体造血细胞来源于供体造血干细胞，而骨髓niche仍为受体来源，因此理论上受体骨髓niche，尤其是血管niche可为急性GVHD的靶器官。由此，我们设想急性GVHD导致骨髓niche尤其是血管niche功能缺陷，从而影响niche对供体正常HSC的功能调控，引起HSC牛物功能改变和数量减少。因此研究急性GVHD是否通过导致骨髓血管niche功能缺陷从而引起造血功能障碍和初步阐明其机制，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。木研究拟解决

4、以下几个丰要问题：1．如何鉴定小鼠骨髓窦内皮细胞?建立主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex；MHC)半相合小鼠骨髓移植aGVHD模型，利用多参数设门，流式细胞术分选骨髓窦内皮细胞，并用细胞化学染色等手段鉴定。2．aGVHD对骨髓窦内皮细胞的影响及其机制如何?采用流式细胞术和骨髓组织病理学、RT．PCR方法检测aGVHD组及对照组(无aGVHD)小鼠骨髓窦内皮细胞的数量、比例、增殖、凋亡及MHC分子表达及T细胞亚群的变化及FasL表达情况。3．aGVHD状态下HSCs牛物学特性变化与骨髓内皮细胞

5、变化的相关性及机制?流式细胞术检测HSC的数量和比例；竞争性及连续性移植模型检测aGVHD对HSC、骨髓微环境的影响；流式细胞术检测骨髓T细胞趋化因子CXCR4及骨髓内皮细胞表达SDF．1表达情况(SDF．1／CXCR4轴)；RT．PCR方法检测HSC中C．Kit及骨髓窦内皮细胞SCF的基因表达强度(SCF／C．Kit轴)。第二军医大学博士学位论丈第一部分小鼠半相合aGVHD移植模型建立和骨髓窦内皮细胞免疫表型及鉴定研究方法小鼠半相合aGVI-ID移植模型的建立：移植受体小鼠：雌性Balb／e(H．2d；表型CD45．2)；供体小鼠：雄性

6、CB6F1(BALB／cH一2d；表型CD45．2)(C57BL／6H．26；表型CD45．1；F1H一2洲；表型CD45．1／2)。随机分为三组：GVHD组每只受体小鼠移植CB6F1来源的骨髓细胞5×106和髀细胞6×107，正常移植对照组每只小鼠仪移植CB6F1来源的骨髓细胞5×106，空白对照组仅接受输注同体积的PBS。半相合移植模型受体小鼠移植前接受8Gy同位素铯照射。观察移植后急性GVHD发牛情况及小鼠生存、检测外周血。取移植后14、21天GVHD及BMT组小鼠皮肤、肝脏、小肠行常规石蜡包埋病理切片，HE染色。流式细胞检测造血细

7、胞CD45．1、CD45．2表达了解植入情况。流式细胞术检测CD150+／CD48．设门检测造血干细胞数量比例骨髓窦内皮细胞免疫表型及鉴定流式细胞术检测正常小鼠骨髓单个核细胞Sca-1、CD45、VEGFR2、VEGFR3表达；SSClow／VEGFR设门分选细胞行VE—cadherin细胞化学染色，荧光显微镜观察阳性率，以分选CD4．／CD8+T细胞作为细胞化学染色对照。结果成功建立小鼠半相合移植急性移植物抗宿主病模型PBS组移植10天后出现死亡，急性GVHD组小鼠10天后逐渐出现腹泻、血便、体重减轻、脱毛、弓背等表现，15天后出现死亡

8、，BMT组全部存活。急性GVHD的发病率为100％；病理切片HE染色提示：可见皮肤、肝脏、小肠组织形态学改变及其中不同程度炎性细胞浸润符合GVHD表现；流式细胞检测提示受鼠造血细胞表型由CD4