无选择标记和无载体骨架序列的转反义acs1基因河套蜜瓜耐贮藏品系选育

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1、内蒙古人学坝Ij学位论义无选择标记和无载体骨架序列的转反义ACSl基因；．--j-套蜜瓜耐贮藏品系选育摘要甜瓜(CucumismeloL．)属于葫芦科甜瓜属，是一年生蔓性革本植物，甜瓜果实营养丰富、甘甜可口、风味独特，深受人们喜爱，被列为世界十大水果之一。我国是甜瓜生产第一大国，约占世界总面积和总产量的一半。本研究选用内蒙古河套地区特产的地方优良甜瓜品种河套蜜瓜。河套蜜瓜是典型的呼吸跃变型果实，果实采后快速出现呼吸高峰，果实迅速软化腐烂。提高果实耐贮性是河套蜜瓜育种重要目标之一。本实验以植物双元表达载体pPZP221(Gen

2、Bank中登录号：U10491)为构建的最初载体，用Mssl和Vspl双酶切pPZP22l，去掉T-DNA上的庆大霉素抗性选择标记基因aacCl(gentamycinacetyltransferasegene)，并在该位点重新插入CaMV35S启动子和I'IOS终止子序列。将甜瓜1．氨基环丙烷一1．羧酸合成酶1(ACSl)基因cDNA编码区0．65kb核菅酸序列反向构建到上述载体的Xbal和Sacl位点。最后用Mssl和妇pl双酶切T-DNA左右边界两侧，获得了无植物选择标记基因和无载体骨架序列的反义ACSl基因的线性表达盒

3、。电泳回收目的片段，回溶于0．1xSSC溶液(pH7．O)中，使中浓度达到10ng／¨L。应用本实验室已建立的甜瓜花粉管通道法转基因技术将目的DNA内蒙古人学烦I：学位论义片段导入受体材料甜瓜品种河套蜜瓜，经选育获得了T。代转基因耐贮藏品系。主要实验结果及结论如下：1、导入了30朵花，收获24颗果实，从每颗果实中随机选取10粒种子播种后经PCR检测，有6颗果实的To种子阳性率较高。2、将从．L-述阳性率较高的六颗果实中各随机选取30粒Tl，种子，播种丁．大田，当果实成熟时在田问筛选出5个耐贮藏植株。3、从耐贮性好的5颗To果

4、实中各随机筛选出30粒种子，种植在育苗盘内，经PCR检测，将阳性苗移栽到冬季日光温室，获得耐贮藏的T，株系。4、转基因T0、T。果实在常温下可贮藏40天。此时，可溶性固形物含量与未转基因对照果实常温贮藏10天时的基本相同，而未转基因对照果实采后20天时已软化腐烂，无法进行测量。5、未转基因对照果实在贮藏10天时，硬度约3．1kg／cm2，且硬度逐渐下降，而转ACC合成酶基因反义片段的To、Tl果实贮藏40天时，果实硬度基本保持4．6kg／cm2左右。6、采后贮藏40天时转基因T0、T。果实的内源乙烯浓度均明显低于未转基因对照

5、果实，约为对照果实的3％．5％。关键词：河套蜜瓜；无载体、无选择标记基因；ACC合成酶基因；选育本项目由国家自然科学基金项目(3066011】)资助内蒙古人学顺Ij学位论义THESELECTIONOFLONGSHELF．LIFESTRAINS0FC己，C(胁Z^S几陋己0L．CVHETA0TRANSFORMEDWITHAVECTORBACKBONEANDSELECTINGMARKER．FREEANTISENSE彳CSJGENEABSTRACTMelon(CucumismeloL，)belongstOtheCucurbitac

6、eaefamily，andisanannualherbaceousrambler．Melonfruitsaretheessentialcomponentsfohumanandanimaldiets．Thisresearchusedamelon(CucumismelonL．CVHetao)varietyasmaterial，whichiscultivatedcropinHeTaoareainthewestInnerMongolia．Itisthetypicalrespiratoryclimactericfruitwhichha

7、dpost—harvestpeakandturnedsoftrapidly．Oneofthemostimportanttargetofbreedingresearchofhetaomelonisimprovingthefruitstorability．1nthisresearch，weusedtheplantbinaryexpressionvectorpPZP221(GenBanksignNo．：U10491)fortheinitialvector．pPZP221wasdigestedbyrestrictionendonuc

8、leaseMsslandVspltoremovethegentamycinacetyltransferasegeneaacC1fromT-DNA，andtheCaMV35Spromoterandnosterminatorsequencewasinsertedintothissite．The