先天性巨结肠ret基因和phox2b基因多态性和肠神经元发育不良病理特点与和ec关系的研究

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1、浙江大学博士研究生学位论文ENSHDnqDADHDN1MCCHSNBEDTAECbpDNAPCRSNPAcheORTEMCILDAbbreviationsHirschsprung’sdiseaseIntestinalneuronaldysplasiaAllieddisordersofHirsehsprung’sdiseaseCongenitalcentralhypoventilationsyndromeEnterocolitisBasepairDeoxyribonucleicacidPolymerasechainreactionSinglenueleotidepolymor

2、phismAeetylcholinesterase，0ddsratioConfidentiaIintervalLinkagedisequilibrium；浙江大学博士研究生学位论文先丙l生巨结肠PET基因和PHOX2B基因多态性和肠神经元发育不良病理特点及与EC关系研究浙江大学医学院儿科学博士研究生导师中文摘要钭金法朱雄凯教授第一部分先天性巨结肠RET基因和PHOX2B基因多态性研究研究背景先天性巨结肠(Hirsehsprung'sdisease，HD)，是小儿外科常见疾病，在高加索人，非洲黑人、亚洲黄种人的发病率分别为万分之1．5、2．1，2．8，亚洲人种发病率最高。HD

3、是一种神经嵴源性疾病，当胚胎发育过程中神经嵴细胞迁徙，分化发生停顿或发生细胞凋亡，均会导致远端肠管的神经支配异常而导致lID。近年来通过遗传连锁分析和基因敲除等技术，发现有以下基因的突变与HD的发病有关：编码有关酪氨酸激酶通路基因(包括RET原癌基因，GDNF基因，GFRa-I基因等)，编码血管内皮素信号通路的基因(包括EDNRB基因，EDN3基因和ECE-I基因)，编码转录因子的基因(如SOXl0基因和PHOX2B基因)等。其中RET基因表达对肠神经元细胞的发育十分关键，在HD的发病中最为重要．但对HD进行大量PET基因突变研究发现，仅有20％左右的散发性和50％左右家族

4、性HD存在突变，而且缺乏类似肿瘤相关的热点突变，另外HD相关RET突变有不完全外显(incompletepenetranee)，呈突变效应性别相关性。更为重要的是，在家族性病例，遗传连锁分析定位遗传位点在10q1I．2，却仍缺乏RET编码区突变。随着SNPs疾病相关性研究的进展，对HD的RET基因研究重点逐渐转移到多态性的研究上．尚未证实单个SNPs导致HD相关PET功能改变，但可能有精确的SNPs组合(单倍型)决定调节意义．在高加索人种，发现有数个PET编码区SNPs与散发性liD相关：A45A(e135G>_A；exon2)和L769L2浙江大学博士研究生学位论文(c2

5、3071’>lLcxon13)。对RET基因启动子的研究发现，在RET编码序列上游的启动子的两种多态性．5G>A和-A>C与HD相关．目前对RET基因的研究，均局限于编码区的突变及SNPs研究，虽然也有少量非编码区(内含子和启动子)的研究，但缺乏相应的功能研究。PHOX2B基因表达研究证明，PHOX2B编码的同源域蛋白与多种非肾上腺素能神经元的发育有关，因此推断PHOX2B基因的改变可能与自主神经发育异常性疾病相关．在小鼠胚胎学研究发现。一旦成肠细胞进入到前肠间叶，即有PHOX2B蛋白表达，并贯穿肠神经元发育的始终。PHOX2B基因突变纯合子小鼠全胃肠道缺乏神经元，与lid

6、病变相似，同时，该突变的小鼠无RET蛋白表达，因此推测PHOX2B基因可能与liD有关。Gareia-Bareelo通过对91例单纯HD研究，发现PHOX281364A>G多态性与lid有关。目前对PHOX2B基因与临床疾病的关系研究尚处在起步阶段。PHOX2B基因与HD的研究也仅有个别报道，PHOX2B基因是否参与liD的发病机制仍有待进一步的研究。根据Hapmap组织统计数据，不同种族人群的SNPs分布频率有明显差异，RET基因和PHOX2B基因SNPs也是如此，这可能是不同种族人群lid发病率有明显差别的原因之一．本课题拟通过对浙江汉族人群liD患者和正常人群的对照研

7、究，分析RET基因和PHOX2B基因SNPs与HD发病之间的关系。不同类型HD与基因SNPs关系，进一步推断主要的lid相关单倍型，并对照其他种族人群已有数据，分析浙江汉族人群的SNPs分布特点。同时应用免疫组化法。检测RET基因启动子多态性与RET蛋白表达之间的关系。材料和方法1．病例收集及标准(1)病例组：全部病例均为本院的浙江籍先天性巨结肠患儿．共123例．根据2005年第四届国际巨结肠与相关神经嵴源性疾病会议的巨结肠诊断标准，重新阅片确定．(2)分组及标准：将巨结肠分为短段型与长段型两种。短段型IAD：病变