大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积引起的外周血t细胞应答(3865)

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果．据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：叠厶是日期：洲6．‘．1中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知

2、识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：t墅丛指导教师签名：‘辞大鼠脑内p淀粉样蛋白沉积引起的外周血T细胞应答目的阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是年龄相关的慢性神经系统退行性疾病，严重影响老年人的生活质量。因此，研究AD的发病机制，探索

3、防治AD的干预靶点，是神经科学的工作重点。AD动物模型是研究工作的重要工具。在对AD发病因素的研究过程中，发现B淀粉样蛋白(beta—amyloidprotein，AB)在脑内的沉积是AD发病的早期过程和中心环节。聚集态的A[3发挥神经毒性，启动了AD的病理进程，包括胶质的广泛活化、炎性微环境产生、神经元功能紊乱及死亡等。AB的沉积活化脑内具有吞噬活性的小胶质细胞，引起先天性免疫应答(innateimmuneresponse)。AB能否募集外周血免疫细胞穿过血脑屏障进入脑向炎症部位聚集，引起过继性免疫应答(adaptiveimmuneresponse)

4、尚不清楚。血脑屏障由微血管内皮细胞、基底膜和星型胶质细胞的足突构成，将脑实质和血液分开，正常情况下免疫系统的细胞和分子不能自由进入脑。但是，随着研究不断进展，人们逐渐认识到，即使在生理状态下，中枢神经系统内也存在免疫监视过程。外周淋巴细胞可以主动进入脑实质，启动脑内的免疫应答，清除可能会引起脑病变的因子。淋巴细胞穿过血脑屏障是一个复杂的过程。淋巴细胞和微血管内皮细胞表面表达的黏附分子及其受体的相互作用发挥了重要作用。本研究室陈誉华课题组在研究AD病人T细胞穿过血脑屏障机制的过程中，发现AD病人外周血T淋巴细胞穿过血脑屏障体外模型——人脑微血管内皮细胞单

5、层的能力显著增高；并且证实AD病人外周血T淋巴细胞高表达巨嗜细胞炎症蛋白一1仅(macrophageinflammatoryprotein—lot，MIP—ld)；MIP一1a通过调控内皮细胞骨架而引起内皮细胞间的紧密连接开放。基于此，本研究采用立体定向注射的方法，建立AB在脑内沉积的动物模型，旨在研究外周血T细胞所表达的MIP—let是否为T细胞穿过血脑屏障的决定因子，同时分析人脑的T细胞在AD病变中的可能作用。方法1、建立脑内沉积A13的动物模型制备聚集态A13。一北和Ap舢。，通过立体定位技术将A13。．北注射到Wist-Hi"大鼠双侧海马，对照

6、组注射等体积的Ap。：．。和PBS。2、标本采集与处理分别于海马注射后3天、7天和14天，从大鼠心脏采血，肝素抗凝。然后经左心室依次灌注生理盐水和4％多聚甲醛，立即取脑。制备冰冻切片时，脑组织经后固定和蔗糖溶液浸泡，冰冻切片机上行冠状切片，片厚101山m，隔10取1，连续取10张切片。制备石蜡切片时，脑组织经后固定和常规脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，石蜡切片机上行冠状切片，片厚5岬，隔10取1，连续取10张切片。3、实时定量PCR法检测外周血T细胞中MIP一1et和CCR5mRNA的表达水平构建用于实时定量PCR分析的标准品质粒pUCmT』MIP—lo

7、t、pUCmT—CCR5和pUCmT—GAPDH：利用单个核细胞分离液和MagCeUectRatCD3+TCellIsolation试剂盒，分离外周血T细胞。通过Trizol试剂提取T细胞总RNA，并反转录成cDNA。根据MIP—let、CCR5和GAPDH的基因序列，按定量PCR检测的要求设计引物和Taqman探针。利用PCR技术从T细胞扩增MIP一10t、CCR5和GAPDH基因片段。通过T—A克隆将MIP—lot、CCR5和GAPDH基因片段连接到pUCmT载体上，命名为pUCmT—MIP—let、pUCmT—CCR5和pUCmT—GAPDH。将

8、重组质粒转化感受态细菌DHSot，通过蓝白筛选，酶切鉴定，验证插入片段的存在。将重组质粒送交测