莲子β葡萄糖苷酶特性及其对荷叶饮料增香作用的研究

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1、华中农业大学2008届硕士学位论文莲子p一葡萄糖苷酶特性及其对荷叶饮料增香作用的研究摘要p．葡萄糖苷酶(EC3．2．1．21)，属于水解酶类，能够水解结合于未端、非还原性的p—D一糖苷键，同时释放p．D一葡萄糖和相应的配基，是植物中醇系香气形成的关键酶类。近年来，对于p．葡萄糖苷酶的相关研究很多，但对于水生植物来源的p．葡萄糖苷酶却鲜有报导。本文首次对莲子中p．葡萄糖苷酶的提取、酶活性分析条件以及分离纯化、酶学性质做了初步研究。并尝试将莲子p一葡萄糖苷酶应用于荷叶饮料中，结合顶空固相微萃取法(HS．SPME)和气相一质谱联用仪(GC—MS)对荷叶饮料的香气成分及莲子B一葡萄糖

2、苷酶对其增香效果进行了研究。主要实验结果如下：l莲子p一葡萄糖苷酶酶活性分析和提取条件本文采用pNPG法测定p一葡萄糖苷酶的活性。特征吸收波长、反应时间、温度和反应的缓冲液的pH值都会对p一葡萄糖苷酶活性的测定产生一定的影响。通过实验确定的最佳酶活测定条件为：测定波长：400nm；反应pH值：5．0；反应温度：56℃；反应时间：60min。按此方法测得新鲜莲子的酶活为1．78U／g，而干燥后的莲子酶活仍然有1．26U／g(两者均为折算为每克新鲜莲子酶活)。在酶液的提取过程中，缓冲液的种类和pH值对酶活有着很大的影响，本文实验表明在提取莲子中D．葡萄糖苷酶时使用pH6．0的柠檬

3、酸一磷酸氢二钠缓冲液效果较好，在酶的提取过程中样品与PVPP的最适比为5：1。2莲子D．葡萄糖苷酶的分离纯化莲子p．葡萄糖苷酶的硫酸铵盐析范围为50％一70％的饱和度，这个分级范围内包含有87．6％的酶活力。选用DEAE．52纤维素进行离子交换柱层析，选择分别含0mol／L、0．1mol／LNaCl和0．3mol／LNaCl的pH8．5的嘶s—HCl缓冲液为洗脱液做梯度洗脱。经此离子交换柱层析后，纯化倍数为18．28，比酶活力达到286．67×10一U／mg。再经SephadexG一100纯化，纯化倍数可达32．57倍，比酶活力达到510．83x10一U／mg，不过，经过一系

4、列纯化过程后，酶的总活力大幅度下降，酶的得率仅为1．29％。3莲子D．葡萄糖苷酶的酶学性质莲子p一葡萄糖苷酶的最适反应温度为56。C，最适pH为5．0。热稳定性实验表明莲子p一葡萄糖苛酶特性及其对荷叶饮料增香作用的研究酶在30．50℃下较稳定，保温150min后仍然有较高的酶活；保存稳定性实验表明，在4℃低温下酶的稳定性较好，保存半个月后，其相对活性仍然可以达到91％；而pH稳定性实验表明在pH5．0到7．0之间，酶较稳定且酶活最大，在碱性条件下酶活和稳定性均大幅度下降。酶对底物pNPG的米氏常数Km值为2．28lmmol／L，最大反应速率Vmax为2．308U／L。SDS．

5、PAGE电泳实验表明莲子p．葡萄糖苷酶可能由两个亚基组成，其分子量分别为39．2KDa和30．1KDa。在低浓度环境下，Ca2+、Mg“、A1“、Zn2+对酶活几乎无影响，M92+在浓度为4．0mmol／L的时候则能明显地促进酶活；A13+和Zn2+在浓度高于6．0mmol／L的时候，能显著地抑制酶活。Vc和半胱胺酸盐酸盐在低浓度(10mmol／L以下)条件下对酶活有很微弱的促进作用。氯化钠和亚硫酸钠对酶活的抑制作用均很明显，且浓度越大，抑制作用越强。4莲子D．葡萄糖苷酶对荷叶饮料的增香作用采用HS．SPME对荷叶饮料香气成分进行提取时，最佳萃取条件为：萃取温度50℃，萃取时

6、间60min，顶空体积40ml。GC．MS分析结果表明荷叶饮料中香气的主要成分为醛类、酮类、醇类，他们占总香气成分的比例分别为19．69％、16．24％、6．25％。莲子B一葡萄糖苷酶对荷叶饮料确实有一定的增香作用，经过酶处理过后的荷叶饮料总香气成分增加了约12％，其中醛类、酮类、醇类这三类主要成分的在总香气中的相对含量变为17．18％、16．54％、8．82％。此外，酶处理对香气中酯类物质含量影响很大，经过酶处理后其在总香气中的相对含量由3．21％上升至7．64％。由于这些香味物质的增加，经过酶处理后的荷叶饮料香气更浓，气味更加柔和。关键词莲子；13-葡萄糖苷酶；提取；分离

7、纯化；酶学性质；荷叶饮料；增香Il华中农业人学2008届硕+学位论文Studyoncharacterizationof13-glucosidasefromlotusseedsanditseffectonlotusleavesbeverage’SaromaAbstract13-glucosidase(EC3．2．1．21)，akindofhydrolyticenzyme，isoneofthekeyenzymeswhichplaysanimportantroleinthealcoholicaromaform