链霉菌R15作用机制及β葡萄糖苷酶的纯化与特性研究

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1、山东农业大学硕士学位论文链霉菌R<,15>作用机制及β-葡萄糖苷酶的纯化与特性研究姓名：王清海申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：丁爱云20060515英文缩略及中文对照表关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有

2、关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：幽导师签名：≤兰簧≥日期：皇盆幺幺莎，／孑山东农业大学硕士学位论文中文摘要土壤中有益微生物种类繁多，其中放线菌占相当大的比例。大多数种类可以产生抗菌物质(抗生素、B．1，3一葡聚糖酶、B一葡萄糖苷酶、B-1，6．葡聚糖酶等)。放线菌及其代谢产物，在农业生产中具有较高的环境效益和经济效益，耐干耐热，便于商业化生产，是一类具有较大应用价值的微生物种群。随着我国种植结构的调整及栽培环境的改变，某些植物病害的发生及危害呈逐年上升趋势，如由卵菌(腐霉菌、疫霉菌、霜霉菌等

3、)引起的辣椒疫病、瓜果腐霉病、瓜类疫病、烟草黑胫病等病害逐年加重。化学防治引起的环境污染和病原菌抗药性的增强，已经引起人们的高度重视，寻找和利用拮抗菌对病害进行生物防治是必然趋势。卵菌细胞壁的主要成份为纤维素，利用有益微生物所产纤维素酶对控制此类病害的发生及危害在理论上是可行的。但许多微生物所产纤维素酶中的B．葡萄糖苷酶含量相对较少，活性较低，限制了纤维素的降解效率，降低了病害防治的效果。本研究旨在对拮抗菌R】5菌株种的鉴定、作用机制、菌体发酵液对3种植物的化感作用以及R15菌株所产0一葡萄糖苷酶的分离、纯化及酶特性进行较系统的研究，为开发利用，研制生防菌剂提供理论依据。其结果

4、如下：1．通过对菌株的培养性状、形态特征、生理生化特性等测定表明：R15菌株菌落圆形，有同心环状，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放射状扩散，粉状；气生菌丝多单叉分枝，孢子丝波曲形或近松螺旋型；基丝无隔，不断裂，孢子丝呈链状直丝；明胶液化，牛奶先胨化后凝固，淀粉水解，纤维素分解，产硫化氢，有黑色素产生，几乎利用所有测试碳源，与对照模式菌株性状基本相同。由此查对文献，初步确定拮抗链霉菌R15菌株为金色链霉菌曲印幻聊wes口“坤姗(w酞smallctGurtis)w酞smalletHenrici。2．平板对峙培养测定R15抑菌活性，结果表明R15菌株对供试的10余种植物病原菌有较好

5、的抑制作用。其中对小麦纹枯病菌抑制作用最好，抑菌带直径达到14．2mm，其次为棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌、辣椒疫霉病菌等，抑菌带直径均达10IIlIn以上。对王清海：链霉菌R．5作用机制及B-葡萄糖苷酶的纯化与特性研究其发酵液的稳定性及作用机制进行了初步研究。结果表明，R15发酵液对棉花枯萎病菌分生孢子萌发抑制作用强，抑制率达98．37％。烟草赤星病菌孢子顶端膨大成球形，不形成芽管；烟草炭疽病菌孢子萌发后不能产生附着胞，且芽管顶端有突起。发酵液处理烟草黑胫病菌、辣椒疫霉病菌致使菌丝畸变、扭曲、菌丝壁消解；R15通过菌丝缠绕、穿透、紧贴的方式重寄生于烟

6、草黑胫病菌菌丝上，致使菌丝断裂。链霉菌R15发酵液的热稳定性和酸碱稳定性较强，在20—55℃，pH3—9范围内都具有抑菌活性。3．3个不同浓度的R15发酵液处理棉花、小麦、辣椒等3种植物，进行皿内沙培试验。对供试植物的出苗历时、根长、根重、苗高、苗重及SOD、POD酶活性等进行测定，初步探讨发酵液对3种植物的化感作用。结果表明，发酵液除对辣椒体内POD酶活性有促进作用外，对根长、根重、株高、苗重、体内sOD酶活性均有不同程度的抑制；发酵液可以促进棉花幼苗根系生长、提高体内SOD酶活性；对小麦生理生化指标无显著性影响。4．R15菌株粗酶液依次经过(NH4)2S04分级沉淀、DEA

7、E．52阴离子交换柱层析、seplmdexG75凝胶柱层析三步，将链霉菌R15所产p一葡萄糖苷酶分离纯化，纯化倍数16．28，回收率为14．59％，sDs—PAGE电泳测得相对分子量为63．89kDa。经TLc分析酶解产物，p一葡萄糖苷酶与水杨苷反应生成D一葡萄糖和水杨醇，证明该蛋白为B一葡萄糖苷酶。5．酶特性研究结果表明，该酶反应的最适温度为65℃，70℃以下相对稳定；最适pH为5，pH3～7之间相对酶活在75％以上；cu2+，H矿+，Fe”对6一葡萄糖苷酶有抑制作用，其中H92+，cu2