yap在非小细胞肺癌中的表达与其在肺癌发生发展中的可能作用和机制 (1)

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1、山东大学博士学位论文个独立的预后指标。而Zhang等发现YAP能增强卵巢癌细胞株的转化表型，并且可以诱导卵巢癌对化疗产生抵抗和耐药；YAP表达增强提示患者预后不良。从以往的研究中我们知道，细胞对化疗药物的敏感程度依赖于功能p73基因的活性，而c-Jun通过稳定p73基因来促进顺铂治疗后的细胞凋亡。Danovi等证实在c—Jun所介导的顺铂所诱发的细胞凋亡中，YAP是新的和关键的下游效应因子。YAP通过与E3泛素蛋白连接酶竞争来稳定p73，从而促进细胞凋亡。综上所述，YAP在多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中表达增强，并与肿瘤的分期、转移、化疗敏感

2、性、预后等相关，提示它有可能是重要的癌基因，可能在肿瘤发生和发展中发挥着重要作用。但是，也有个别报导认为，YAP在乳腺癌的发生中可能发挥了抑癌基因的作用。因此，本研究旨在观察YAP在NSCLC中的表达情况以及与NSCLC分期、分级、分化、转移等的相关性，推测其在NSCLC发生、发展中可能发挥的作用和机制。研究目的1．免疫组化技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况；2．WesternBlot技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况；3．RT—PCR技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况；4．观察YAP在不同年龄、性别、不同病理类型

3、、不同分期和分级的NSCLC中的表达情况，统计学分析其相关性，推测YAP在肿瘤发生、发展中的可能作用和机制。研究方法1．选取2009年1月～2010年1月山东省立医院胸外科手术治疗的原发性肺癌患者40例，均未接受过化疗或放疗。2．分别取肿瘤组织标本和距肿瘤可视边界2cm以上区域的癌旁组织标本各125mmm3，立即放入一80。冰箱保存备用。3．40例患者中，男28例，女12例；患者年龄40～75岁，中位年龄57岁。4．根据国际抗癌联盟(UICC)2002年修订的肺癌分期标准，I期17例(Ia4例，Ib13例)，II期12例(IIal例，Ⅱb

4、11例)，HI期1l例(HIa8例，IIIb3例)；其中T1期5例，T2+T3+T4期35例；5．根据病理学分型鳞癌18例，腺癌20例，鳞腺癌1例，大细胞癌1例；山东大学博士学位论文6．根据有无淋巴结转移分为N018例，N。12例，N。10例；7．根据分化程度，高分化4例，中分化29例，低分化7例；8．该研究所有程序符合山东省立医院负责人体试验委员会所制定的伦理学标准，并得到该伦理委员会的批准；9．免疫组化技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况9．1标本经4％福尔马林固定、逐级脱水、石蜡包埋后做病理切片，切片厚度为4um；9．2放入3

5、％H20：中室温20分钟以去除内源性过氧化物酶；PBS液浸泡，每次5分钟，连续3次；9．3滴加封闭血清，37℃孵育30分钟；9．4每张切片滴加20ul用PBS稀释的小鼠抗人YAP一抗(1：200、上海瑞齐生物科技有限公司)，阴性对照切片只滴加相同剂量的PBS溶液；9．54"C冰箱孵育过夜，次日37。C孵育30分钟；PBS(PH7．4)清洗3次，每次5分钟；9．6每张切片滴加20ulPBS稀释的HRP偶联羊抗小鼠二抗(1：200稀释、北京中杉金桥生物技术有限公司)；PBS清洗3次，每次5分钟；9．7滴；On-氨基联苯胺(DAB)显色液(北京

6、中杉金桥生物技术有限公司)，镜下控制显色时间；PBS冲洗，苏木素对胞核复染；逐级酒精脱水；中性树胶封片。9．8每张切片选取5个×400视野，应用LeicaQwinV3图像分析系统，计算每一视野阳性表达区域的平均灰度值。10．WesternBlot技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况10．1应用SDS裂解液(1．74mg／ml(10mmol／L)PMSF(苯甲基磺酰氟)：PMSF0．1749，异丙醇lOOml，溶解后分装于1．5ml离心管中，一20℃保存)从新鲜NSCLC组织中提取总蛋白；10．2每个样本取30ug总蛋白经IO％SDS

7、-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜(GEHealthcare)上：10．3YAP蛋白检测用小鼠抗人YAP单抗(1：500稀释；上海瑞齐生物科技有限公司)13-actin蛋白作为内参照。山东大学博士学位论文10．4DAB显色后TotallabTLl20凝胶分析系统计算各样本条带的积分光密度(IOD)，计算YAP蛋白的相对量。11．RT-PCR技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况11．1应用RNAisoPLUS试剂盒(TaKaRa公司，中国)从每一样本(约50mg)提取总RNA：11．2应用PrimeScript1stStrande

8、DNASynthesisKit(TaKaRa公司，中国)进行反转录；11．3应用PremixTarVersion2．0kit进行PCR扩增。体系容量为20ul，反应条件：94℃3分钟预变性，9