人ptp1b克隆表达与豹皮樟总黄酮治疗2型糖尿病大鼠部分机制研究论文

《人ptp1b克隆表达与豹皮樟总黄酮治疗2型糖尿病大鼠部分机制研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、安徽医科大学博士学位论文鲁云霞2009年人PTP1B克隆表达及豹皮樟总黄酮治疗2型糖尿病大鼠部分机制的研究博士研究生鲁云霞导师李俊教授（安徽医科大学药学院，合肥，230032）∗中文摘要蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）属于蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族,以跨膜受体样蛋白和胞内酶2种形式存在，催化蛋白质的磷酸化酪氨酸残基的去磷[1，2]酸化反应，是哺乳动物体内最早被鉴定、纯化的PTPs。PTP1B作用于胰岛素受体(IR)，胰岛素受体底物1、2(IRS-1，IRS-2)，生长因子受体结合蛋白2(Grb2)，磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)等与胰岛素信号转导相关的蛋白，

2、使它们的磷酸化酪氨[3]酸残基脱磷酸，衰减胰岛素信号转导，从而产生受体后的胰岛素抵抗。最近有人[4]向小鼠的肝细胞瘤中导入针对PTP1B的siRNA，结果发现胰岛素信号转导增强，再次证实了PTP1B在胰岛素信号通路中的作用。PTP1B的高表达除了引起胰岛素抵抗外还可引起瘦素抵抗，从而引发2型糖[5，6]尿病（T2DM）及肥胖。PTP1B基因敲除鼠不仅胰岛素敏感性增强，而且去除了PTP1B对胰岛素和瘦素信号转导的抑制，使小鼠在高脂饮食条件下也不发生肥[7]胖，且发育良好，具有正常的繁殖能力，癌症的发生率也未见提高，这提示了PTP1B作为胰岛素信号通路的主要负调控因子，其

3、小分子抑制剂可能是有效的抗糖尿病/肥胖症药物，而且不产生副作用。事实上PTP1B抑制剂已成为胰岛素增敏[8]剂的候选药物之一，全世界有不少实验室正在从天然中草药或人工合成的药物中以PTP1B作为靶点筛选高特异性的抑制剂。[7]PTP1B与肥胖症、T2DM和肿瘤关系密切，因此它的大规模诱导表达对研究∗安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目（No2006KJ095A），安徽省教育厅自然科学基金项目（2006KJ371B）4安徽医科大学博士学位论文鲁云霞2009年这些疾病有着重要的意义。本研究将PTP1B基因作为T2DM合并肥胖症的重要候选基因，结合豹皮樟总黄酮（TFLC）

4、对T2DM大鼠模型的疗效及降糖机制研究，为TFLC应用于临床治疗肥胖合并2型糖尿病提供前期试验依据。主要研究内容包括以下四个方面：1.人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达-2取2型糖尿病人（BMI>28kg·m）外周抗凝静脉血，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，提取总RNA，以OligodT为引物，合成出cDNA第一链。以逆转录（RT）产物为模板，PCR扩增出PTP1B插入片段，连接入克隆载体pMD-18TVector中构建pMD-hPTP1B。设计带酶切位点（BamHⅠ，EcoRⅠ）的引物，以pMD-18TVector作模板进行亚克隆，双酶切后构建原核表达载

5、体pET28a(+)-hPTP1B，氯化钙法转化入BL21（DE3），IPTG诱导表达并对诱导剂的浓度、时间及诱导温度等条件进行了优化。从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bpPTP1BcDNA全长序列，经双酶切鉴定及测序分析，表明已成功构建了原核表达载体-1pET28a(+)-hPTP1B；IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol·L，最适诱导时间为5h，最适诱导温度为37℃；Westernblot表明表达的重组融合蛋白具有与天然hPTP1B相同的结合抗体活性。2.rhPTP1B蛋白的分离纯化、酶活性测定以及抑制剂实验亲和层析法纯化rhPTP1B，复性后用于酶活

6、性测定及抑制剂的实验。取细菌2+裂解上清液经Ni亲和层析柱纯化后，利用PTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定rhPTP1B的活性，分析其与rhPTP1B浓度、底物浓度及反应温度的关系，确定钒酸钠（Na3VO4，VAN）的抑制类型和豹皮樟总黄酮(TFLC)对rhPTP1B的抑制作用和浓度依赖关系，并研究2型糖尿病常用治疗药物吡格列酮和二甲双胍对rhPTP1B有无抑制作用，探讨其5安徽医科大学博士学位论文鲁云霞2009年有无新的降血糖机制。结果表明诱导表达纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究：1.rhPT

7、P1B活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加；2.35℃时rhPTP1B的活性最大；3.VAN的抑制作用呈浓度依赖性增强，可能为非竞争性抑制作用；4.TFLC对rhPTP1B有明显的抑制作用；5.治疗2型糖尿病的常用药物二甲双胍和吡格列酮对PTP1B酶并无明显抑制作用，说明这两种药物不是通过对PTP1B的抑制起作用的。3.人PTP1B基因的真核系统表达及在HepG2细胞的胰岛素信号通路中的作用构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B，电穿孔法转染至人肝癌HepG2细胞，G-418筛选2周后得到稳定转染的细胞株，检测rhPTP1B在转录水平和翻译水平