胰岛素对糖尿病鼠皮肤创伤的促愈合机制和大鼠胰岛细胞的分离纯化

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1、·中文论著摘要·胰岛素对糖尿病鼠皮肤创伤的促愈合机制与大鼠胰岛细胞的分离纯化目的糖尿病(diabetesmellitus，DM)是目前严重危害人类健康的常见病、多发病。全世界约有2％巧％的人患有此种疾病。我国在2000年DM患病人数就已达到3000多万，且呈逐年增长趋势，因此预防和治疗DM已成为国家科技攻关的重要项目。有人报道DM病人皮肤溃疡或外科术后难愈合伤口可局部应用胰岛素(insulin，INs)来促进其愈合，但其具体机制仍不清楚。本研究首先建立DM大鼠创面难愈模型，在不同时间点观察了表皮干细胞(epidemmlstemcells，ESCs)的动态变化规律，然后在创伤

2、局部应用INS，观察某个时间点ESCs和创面愈合率的变化，并探讨了二者之间的关系及机制，为临床研究和治疗DM仓iJ伤提供了科学基础。DM患者容易并发皮肤溃疡或创伤后难以愈合，常常成为DM患者致死致残的重要原因之一。目前的研究认为，DM创面难愈的机制主要集中在以下几方面：①糖代谢紊乱及其晚期糖基化终末产物增多；②微血管的改变；③基质金属蛋白酶的表达异常；④表皮生长因子受体的改变；⑤表皮细胞增殖障碍。在创面愈合过程中，这些因素都不是单独发生的，而是以一个高度协调、互相影响的方式进行的。而ESCs是组织特异性干细胞，具有强大的增殖能力，既能自我更新以维持ESCs数量平衡，又可向各

3、阶段表皮细胞分化以维持皮肤代谢，尤其在皮肤发生创伤时，ESCs更是皮肤重建的关键“种子细胞”。那么，DM创伤后ESCs的变化是否有别于正常状态仍不清楚。此外，临床上有局部使用小量INS溶液加速伤口愈合的经验，其是否通过启动ESCs起作用仍待进一步研究。本实验通过常规HE染色、免疫组化染色和Westernblot等方法观察了DM大鼠创伤后不同时期表皮厚度、ESCs的数量变化和分布特征及创面愈合率，进而探讨了ESCs与DM皮肤创面难愈之间的关系。在此基础上，进一步研究了DM创面局部应用INS后ESCs的定位、数量及创面愈合率的变化，并对两者之间是否存在相关关系进行了探讨，从而进

4、一步明确了创面局部应用INS是否通过ESCs发挥了促进DM创面愈合的作用。此外，又进行了Wistar大鼠胰岛细胞的分离和纯化，为以后对ESCs进行基因改造或与支架联合培养移植促进DM创面愈合提供了理论和实验基础。方法1、建立模型将体重为180～2009的雄性Wistar大鼠(68只)随机分为模型组(44只)和正常组(24只)。前者采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin，STZ，65mg&g)的方法制作DM模型。成模3周后，用特制打孔器在两组所有大鼠的背部、脊柱两侧各打一直径为1．Sere、面积为2．54cm2的创面，作为创面难愈模型。然后从模型组中随机挑选24只作

5、为DM组，正常组24只健康大鼠作为对照，观察DM对皮肤创伤后ESCs的影响。再从模型组中随机挑选12只大鼠，分为对照组(6只)和实验组(6只)，观察局部应用INS后对DM创面中ESCs的影响。2、观察DM对皮肤创伤后创面中ESCs的影响对DM组和正常组中大鼠的创面止血后用无菌纱布包扎，以后每日清洁创面。于创面制作后第3d、7d、14d和21d观察大鼠皮肤愈合及感染情况，计算创面愈盒率{’同时在每个时间点每组处死6只大鼠，取其创缘及肉芽组织，固定，常规石蜡包埋，切片。按每连续3张切片为一组，分别编号为A、B、C。A组行HE染色，观察创面组织学变化及测量表皮厚度；B组和C组分别

6、行K19和B1整合素免疫组织化学染色，观察ESCs的数量和位置的变化。3、观察局部应用INS对DM创面中ESCs的影响从创伤后第1d开始，对实验组大鼠创面局部施加INS治疗(SU／只)，而对对照组大鼠则施加等量生理盐水做对照，隔日一次。在第一次施加INS前及施加后第1h，2h，3h，4h，6h，12h和24h测量所有大鼠血糖浓度。创伤后第14d，所有大鼠被处死，测量创面面积，同时取创缘皮肤，一部分用4％多聚甲醛固定，行HE染色、K19和81整合素的免疫组化染色，另一部分于一70℃冷冻保存，用Westernblot的方法检测K19和B1整合素蛋白的相对含量。4、Wistar大

7、鼠胰岛细胞的分离与纯化采用肝胰管内灌注胶原酶的方法消化分离胰岛，Fie011400密度梯度离心纯化。2纯化后的胰岛经组织学染色、电镜及放射免疫来鉴定其特异性和活力。5、统计学处理所有数据均以Z士s表示，用SPSSl3．0软件进行统计学分析。结果1、模型鉴定注射STZ72h后，监测随机血糖、体重和饮水量，连续3次血糖值≥16．8mmoFL，并出现典型的“三多一少”症状者，即可确定为DM大鼠。共有39只大鼠造模成功。2、DM对皮肤创伤后创面中ESCs的影响(1)创面愈合的宏观和微观观察结果正常组大鼠创面干燥、红润，分泌