利用毕赤酵母表达小c肽人胰岛素原的研究

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1、硕士学位论文利用毕赤酵母表达小C肽人胰岛素原的研究摘要胰岛素（Insulin）是临床治疗糖尿病的特效药，具有广阔的应用前景。重组人胰岛素基因曾被成功地在大肠杆菌(Escherichiacoli)和酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中的表达，但是存在着难以复性和表达量较低等缺点。毕赤酵母（Pichiapastoris）具有严格调控外源蛋白的表达、加工修饰表达产物、表达量高、营养要求低等优点成为表达外源蛋白的理想表达系统。本研究根据植物偏爱密码子化学合成了小C肽人胰岛素原全基因（B-(H)6LQPK-A），将该小C肽人胰岛素原基因（BC’A）插入到酵母

2、表达载体pPICZaA中，经线性化后，电击法转化毕赤酵母GS115，利用PCR筛选出了阳性转化菌株，从而成功构建了人胰岛素原的毕赤酵母表达体系。阳性菌株经甲醇诱导培养，发酵液上清液经Tricine-SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定，发现3株菌株（1#，13#，20#）成功表达了人胰岛素原，同时研究了20#菌株的表达量随时间的变化关系，揭示了His-tag位于C肽时对分离纯化的影响，为进一步研究该基因在P.pastoris和转基因植物中的表达奠定了基础。关键词：小C肽人胰岛素原毕赤酵母分泌表达I硕士学位论文STUDYONEXPRESSIONOF“MINIC”

3、HUMANPROINSULIN(B-(H)6LQPK-A)INPICHIAPASTORISABSTRACTAsthespecialdrugforDiabetesMellitus,insulinhasbroadapplicationprospects.AlthoughhumaninsulinhasbeensuccessfullyexpressedinEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiae,problemsstillexistsuchasthedifficultrefoldingfortheE.colisystermandlowyi

4、eldforS.cerevisiaesystem.Pichiapastorisisanidealheterologousgeneexpressionsystembecauseofmanyadvantagessuchasproteinsprocessing,foldingandpost-translationalmodification,whilebeingeasytomanipulateandgivinghigherexpressionlevels.Inthisstudy,the“MiniC”humanproinsulinanalog(B-(H)6LQPK-A,BC’A)

5、wassynthesizedaccordingtotheplantcodonbiasandtheninsertedintothesecretingplasmidpPICZaA,resultingintherecombinantplasmidpPICZaA-BC’A.TheplasmidpPICZaA-BC’AwaslinearnizedbyrestrictionendonucleaseSacIandtransformedintothestrainGS115byelectroporation.ThepositivestrainwasidentifiedbyPCR.After

6、fermentationoftheselectedstrains,thefermentationsupernatantwasdeterminedbyTricine-SDS-PAGEandwesternblotandtheresultsindicatedthatthreetransgenicyeaststrainsII硕士学位论文(1#,13#,20#)couldhighlyexpressandsecretethe“MiniC”humanproinsulin.Therelationshipoftheexpressionofstrain20#andtheinductionti

7、mewasstudiedandtheimpactofHis-taglocatedinCpeptideonseparationandpurificationwasalsorevealed.ThisstudyprovidesabasisforfurtherexpressionofhumaninsulininP.piastorisandinplants.KEYWORDS:“MiniC”humanproinsulin;Pichiapastoris;SecretedexpressionIII硕士学位论文英文缩略词表（Abbreviati