枯草杆菌血栓溶解酶的液体发酵与分子修饰研究

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1、摘要本论文以稻草中分离的枯草杆菌SBS为出发菌株，以枯草杆菌血栓溶解酶(BacillusThrombolytieenzyme，以下简称BTE)为研究对象，研究了BTE产生的液体发酵工艺以及BTE的分离和纯化并对BTE分子进行了聚乙二醇(PEG)化修饰，以期改进其酶学性质，为今后的应用奠定基础。结果表明：通过正交实验得出的最优培养基组成(g／L)：燕麦麸皮7，可溶性淀粉3，大豆分离蛋白25，CaCl20．2。采用优化后的培养基进行了15L发酵罐的发酵试验，菌种种龄lOh，接种量5％，通气搅拌，温度37℃，初始pH8．0，发酵70h后BTE酶活力达到542IU／

2、mL。BTE分离和纯化方法的研究结果表明：发酵液经过25％．70％硫酸铵分级沉淀、DEAE．52阴离子交换色谱和SephadexG75凝胶过滤色谱等步骤，得到BTE纯酶，回收率为80．66％，纯化倍数为12．27，比活达到11854IU／mg。该酶经SDS．PAGE湿示为单一电泳带，分子量为32KDa。经Fibrin．SDS—PAGE电泳检验，料酶溶液中只有分子量为32KDa的枯草杆菌血栓溶解酶具有溶解血纤维蛋白的能力。合成了以谷氨酸为中心分子的分枝型PEG修饰剂对BTE进行了定点修饰。实验结果显示修饰后酶的活力急剧下降，SDS．PAGE图谱条带模糊，没有达

3、到预期的效果。关键词：枯草杆菌血栓溶解酶；液体发酵：分离纯化；分枝型修饰剂；PEG修饰ABSTRACTTheoptimumliquidfermentationtechnology，isolationandpurificationaswellaspegylationofBacillusThrombolyticenzyme(BTE)producedbyBacillussubtil括SBSscreenedfromricestrawwerestudiedinthispaper．TheaimofBTEpegylationwastoimproveitscharacter

4、isticsandgivesomebasisforapplicationinthefuture．111eresultSshowedthattheoptimalfermentationtechnologywereasfollows(g／L)：oatbran7，solublestarch3，soybeanisolateprotein25，CaCl20．2，naturalpH8．0at37"Cwithinoculationage10h．inoculationvolume5％．Undertheaboveconditionstheliquidculturewascar

5、riedoutfor70hin15Lbioreactor,TheactivityofBTEamountedto542IU／mL．TheisolationandpurificationoftheBTEwerestudiedusingammoniumsulfatefractionprecipitationandion·-exchangechromatographyonDEAE·-52andSephadexG75gelfiltration．ThespecificactivityofpurifiedBTEwas1l854IU／mL，andpufificmionfol

6、dwas12．27andayieldof80．66％．SDS—PAGEdisplayedonlyoneband，andthemolecularweightofBTEwasestimatedtobe32KDa．Fibrin-SDS-PAGEshowedonly32KDaproteinhadthethrombolyticability．Site-directedpegylationmodificationofBTEWasstudiedwimbranchedPEGsynthesizedwithglutamicacidasthecentralmolecule．The

7、resultsindicatedthatBTEactivitydecreasedrapidly,SDS-PAGEbandblurred，80theaimnotrealized．Keywords：Bacillussubtilisthrombolyticenzyme，liquidculture，separationandpurification，branchedPEG，PEGylation，天津科技大学硕士学位论文1前言1．1我国农副产品加工废弃物利用现状我国是一个农业大国，近年来，随着农业经济的发展，农作物产量不断提高，农副产品加工废弃物数量也呈上升趋势，特别

8、是农民生活水平的改善，对可用作燃料和肥料的农副产品加