苏云金芽胞杆菌幕虫亚种晶胞粘连现象和其内生质粒有关

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1、华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学似论文卺如需保密，解密时问年月日是否保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究1-作及取得的研究成果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为萨得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师两此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所敛的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：鞫哥勇时间：1枷‘年f月如日学位论文使用授权书本人完全

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3、录之M华中农业大学硕士论文鞠守勇摘要苏云金芽胞杆菌幕虫亚种(Bacillusthuringiensissubsp．finitimus)YBT-020，含有三个内生质粒，能形成两种伴胞晶体。当芽胞形成细胞裂解后，一种晶体被释放出来，形成自由的伴胞晶体，另一种在芽胞外壁内侧形成，成熟后被包裹在芽胞外壁以内不脱落，始终和芽胞粘连在一起。PCR筛选了2162个经过高温消质粒处理的YBT020菌落，其中75个消除了cry26Aa基因：19个菌落同时消除了cry26Aa和cry28Aa基因。通过脉冲电泳和S

4、outhern杂交分析得到了仅消除cry26Aa所在质粒的菌株BMBI151和其无质粒的菌株BMBl152。从形态学，生理生化和SDS．PAGE三个方面对YBT020，BMBll51和BMBll52做了进一步分析。将cry26Aa和cry28Aa两个基因分别和同时在YBT020无质粒的菌株BMBll52中表达，发现晶体与芽胞独立存在不能粘连；将cry26Aa在仅消除cry26Aa所在质粒的菌株BMBl151中表达，发现晶体与芽胞也独立存在不能粘连，从而推测晶胞粘连现象与cry26Aa所在内生质粒

5、有关。为进一步阐述晶胞粘连的分子机制指明了研究的方向和提供了很好的受体材料。目前电转化的方法普遍用于苏云金芽胞杆菌基因工程，但是电转化的过程中容易造成野生菌株发生突变(内生质粒丢失等)，而且很难将较大质粒(>30Kb)电转化进入苏云金芽胞杆菌中，目前还没有好的方法来实现苏云金芽胞杆菌较大质粒(>30Kb)的转化。通过将OriT插入到穿梭载体pHT304中构建了含有OriT位点的可诱动穿梭质粒pBMB0951，在菌株E．coliS17．1或者帮助质粒pRK2073的作用下，将大肠杆菌中的质粒接合转

6、移到了苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种无质粒菌株BMBl71中，从而实现对苏云金芽胞杆菌的改造，为下一步野生性菌株接合转移系统的建立奠定了基础。关键词：苏云金芽胞杆菌幕虫亚种晶胞粘连接合转移质粒消除华中农业大学硬士论文鞠守勇ABSTRACTBacillusthuringiemissubspfinitimusYBT020wasisulate文whichharboredthreeresidemplasmids．YBT020producedatleasttwoparasporalinclusions，One

7、inclusionformedsomewhatlaterexteriortotheexosporium．Anotherinclusionwasformedwithintheexosporiumandremainedwiththesporeaftermothercelllysis．Inthiswork,therelationshipbetweenthephenomenonofspore·crystalconnectionandtheplasmidswasinvestigated．75colonie

8、scuringofthegenecry26Aa,and19coloniescuringofbothcry26Aaandcry28Aawereobtainedfrom2162coloniesbyPCRamplification．MutantsBMBl151curingoftheplasmidharboringcry26Aa,andBMBl152curingofallplasmidswgl"eobtained．Thenthemorphological,physiological，biochemica