红景天甙生物催化合成的研究

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1、摘要摘要红景天甙是藏药红景天中的主要有效成分，具有抗疲劳，抗衰老，抗肿瘤等多种药理作用，有巨大的商业开发价值。目前，获取红景天甙的方式主要有从红景天植物中进行提取，应用化学方法合成以及红景天植物细胞悬浮培养法，用微生物细胞及微生物来源的B．葡萄糖苷酶在非水相介质中合成红景天甙的方法至今还未报道。研究目的：本试验的目的之一为探索微生物整体细胞催化合成红景天甙的新方法，建立微生物合成红景天甙的反应体系和生产工艺。目的之二为探索微生物来源的D．葡萄糖苷酶在非水相介质中催化合成红景天甙的可行性并初步建立合成体系

2、。研究方法：本试验运用紫外线一氯化锂法诱变育种分别得到米曲霉制霉素抗性突变株和B．葡萄糖苷酶高产株；以高效液相色谱法为主要检测手段；利用大孔吸附树脂柱层析和硅胶柱层析对反应产物进行纯化，红外及核磁分析方法鉴定产物结构；此外，B．葡萄糖苷酶酶活测定方法为水解水杨苷产还原糖法。研究结果：本试验运用微生物成功合成了红景天甙，建立了较为完整的反应体系，并创新性地探索了B一葡萄糖苷酶在非水相介质中合成红景天甙的可行性。以酪醇和D．葡萄糖为底物，从红景天根系土壤菌群中筛选到一株红景天甙合成能力较强的菌，初步鉴定为米

3、曲霉。对米曲霉合成红景天甙的反应条件进行优化，最适底物浓度为酪醇59m，D．葡萄糖与酪醇的摩尔比为1：1，最佳反应时间为48h，最适细胞浓度为150e,m，最适pH为7，红景天甙产量为0．79／L，转化率为14％。由于细胞不能将所合成的红景天甙分泌至胞外，所以为了解除产物抑制提高产率，对米曲霉进行紫外线一氯化锂复合诱变，筛选制霉素抗性突变株。诱变之后，诱变株IM．5可以把红景天甙分泌至胞外，红景天甙产率提高至0．889／L，转化率达17．6％。以米曲霉IM-5整体细胞为催化剂合成红景天甙，反应液经大孔吸

4、附树脂柱层析和硅胶柱层析纯化，所得产物经HPLC，红外及核磁分析鉴定为红景天甙，纯度98％。红景天甙生物催化合成的研究以黑曲霉为出发菌株，经紫外线一氯化锂诱变得到一株p，葡萄糖苷酶高产菌株IK-7，其发酵液冷冻干燥后所得酶粉活力达92U／mg。对B一葡萄糖苷酶在非水相介质中催化合成红景天甙条件进行优化，最适反应体系为环氧乙烷一水(8：2v／v)，最适反应时间为9h，最适振荡速度为150r／min，红景天甙最大转化率为17．1％。关键词：红景天甙；酪醇；生物合成；p．葡萄糖苷酶；非水相介质ABSTRACT

5、SalidrosideisanimportantpharmacologicallyactivecompoundintraditionalChineseherbRhodiolaL．Ithasbeenfoundtopossessmanymedicalfunctionssuchasresistinganoxia，microwaveradiationandfatigue．Salidrosideisa3-D—glucosidewhichisordinarilyobtainedfromplantsRhodiolaL

6、．Besidesthis．itcanbesynthesizedbyseveralmethodssuchaschemicalmethodandsynthesisinsuspensionculture．However，biosynthesissalidrosidebymicroorganismhasn’treportedasyet．Thenaturalresourceofsalidroside(mainlyfromtheplantRhodiolaL．)isonthevergeofexhaustion．The

7、reforeitmaybeavitalalternativetosynthesizesalidrosidebymicroorganism．Objective：(1)Toestablishthereactionsystemtosynthesizesalidrosidebymicroorganism．(2)Toexplorethepossibilitytosynthesizesalidrosideby13-glucosidaseinbiphasicsystem．Methods：Aspergillusoryz

8、aeandAspergillusnigerweremutagenizedbyUVcombinedwithLiCl．TheamountofsalidrosidewasquantifiedbyHPLC．Theproductwaspurifiedbymacroporousadsorptionresinchromatographyandsilicagelchromatography．Thestructureofproductwasanalyzedb