利用限定因子诱导牛ips细胞

《利用限定因子诱导牛ips细胞》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、捅要iPS细胞在家畜新品种培育及细胞重编程机制的研究中具有重要意义。本研究采用慢病毒感染法以融合有绿色荧光蛋白的pSox2、hOct4、pMyc和pKlf4四种限定因子诱导牛胎儿皮肤成纤维细胞为iPS细胞，并对形成的iPS细胞克隆进行鉴定。试验结果如下：牛胎儿成纤维细胞经过慢病毒感染后的第15d开始发生形态改变，由长梭形变成边缘不规则的圆球形。接到饲养层后细胞贴附生长，形态改变的细胞不但数量增多，而且聚集一起呈扁平克隆状致密生长，边界清楚。高倍镜下观察牛iPS克隆细胞核较大，核质比率较高，荧光下观

2、察牛iPS克隆中有部分细胞能够表达绿色荧光蛋白。进一步传代培养，牛iPS细胞克隆数不断增多，而且传至十几代后仍保持稳定增长。冻存．复苏后的细胞继续保持稳定的传代培养性能。待细胞接到饲养层后随着iPS细胞克隆的增殖和稳定传代，绿色荧光表达强度逐渐减弱，而且表达绿色荧光蛋白的克隆也逐渐减少。秋水仙素处理牛iPS细胞克隆进行核型分析检测，结果显示诱导出的牛iPS细胞染色体条数为60，与正常的牛细胞核型相吻合；碱性磷酸酶染色呈阳性。RT-PCR扩增鉴定iPS细胞克隆中多潜能相关基因Oct4、Sox2、Na

3、nog、c-Myc和Klf4的表达情况，结果Oct4、Nanog、c-Myc和Klf4均呈阳性，勋妇为阴性，而作为对照的牛胎儿成纤维细胞中均无上述5种基因的表达。免疫荧光染色法对牛iPS细胞克隆中多能性相关基因的蛋白进行检测，Oct4和Nanog蛋白呈阳性，但其余蛋白表达均呈现阴性。牛iPS细胞克隆在体外悬浮培养的第10d，可观察到拟胚体的形成，并且拟胚体易于聚集融合。将牛iPS细胞多点多次注射到裸鼠背侧皮下，6周后在裸鼠注射部位成功长出大小不等的多个畸胎瘤，取出的畸胎瘤形态呈不规则的圆球状，被一

4、层白膜包裹，质地柔软，侵袭性强，畸胎瘤表面分布很多血管与裸鼠皮下组织相连。经组织切片和HE染色可观察到裸鼠皮下生长的畸胎瘤中存在由内、中、外三胚层分化而来的组织。结论：利用限定因子pSox2、hOct4、pc-Myc和pKlf4成功将牛胎儿成纤维细胞诱导为牛iPS细胞。关键词：牛，胎儿成纤维细胞，限定因子，iPS细胞AbstractInducedpluripotentstemcell(iPSC)bydefinedfactorsisofgreatimportancetoproducingtransg

5、enicanimalsandstudyingthereprogrammingmechanismofcell．So，inthisstudy,weattemptedtoderiveinducedpluripotentcellsfrombovinefetalskinfibroblastcells(bFFC)withfourdefinedfactors．FourlentivirusplasmidscarriedpSox2,hOct4,pMycandpKlf4generespectivelyweretran

6、sfectedinto293Tcells．andtheproducedlentivirusthatcouldgeneratethedefinedfactorswerecollecedandmixed．thenthemixturewasaddedintocellculturemediumtoinfectbFFCs．WecontinuedtoobservethecellmorphologyandGFPproteinexpression．Oncetheshapeoffibroblastscellsbeg

7、antochange，theywouldbeseededontomouseembryonicfibroblastfeeders．Afterseveralpassages，clonieswithclear-edegewereselectedandidentified．Resultsasfollow：Afterinfectedwith1entivirusforl5days．somebFFcellsbegantoexhibitaprogressivemorphologicalchangefromspin

8、dle-shapedtoglobular．Whenseededontofeeder，someflatcolonieswithcuttingedegeformed，Cloniescellshadbigcaryonandexhibitedahi．ghnucleus／cytoplasmratio．Afteradozenpassages，theintensityofgreenfluorescencegraduallydecreasedinthosecloniescells，andthenu