小麦耐盐相关qtl定位的分析

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独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生繇闰矛峰帆一∥年∥盯日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生躲阀“芬帆p一弹歹月，目导师签名：^多己、呷}玉时间：№0年毛月工、日 小麦耐盐相关QTL的定位分析摘要本实验采用温麦6号×山红麦重组自交系群体及已经构建的遗传连锁图，用芽期耐盐指数、胚芽鲜重、胚根鲜重，苗期盐害指数、植株干重、鲜重，株高、根长等耐盐相关指标，采用QTLMapperl。0软件对耐盐相关性状进行了QTL定位。共定位了35个耐盐相关QTL，其中芽期9个．苗期26个，分布在15条染色体上。其中4A染色体C468-M74P50’1间是芽期耐盐指数、胚根鲜重、胚芽鲜重3个性状QTL共同定位的染色体区间，是控制芽期耐盐性的主效QTL位点。5A染色体M41p55一MS304间是苗期盐害指数、地下干重、株高、根长4个性状共同指向的染色体区段，是控制苗期耐盐性的OTL位点。这些OTL位点为分子标记辅助育种和耐盐oTL的图位克隆提供了帮助。关键词：小麦，耐盐性，QTL QTLMappingforSaltToleranceinWheat(TriticumaestivumL．)AbstractApopulationof116recombinantinbredlines限ILs)，derivedfromthecrossWenmai6×Shanhongmai，wasusedtogeneticallyanalysetheresponseofwheattosaltstress．QTLanalysiswasconductedbyusingtheconstructedmolecularlinkagemapandsoftwareQTLMapper1．0．Thisanalysisresultedinidentificationof35mappingto15chromosomes，9wereeffectiveduringgerminationstage，and26atseedlingstage．Threefortraitsrelatedtosaltstressindex，freshweight，fleshweightatthegerminationstageweremappedthesameintervalsC468一M74P50Mofchromosome4A．Fourfortraitsrelatedtosaltsensitiveindex，rootdryweight,plantheight，rootlengthattheseedlingstageweremappedtotheintervalM41p55-MS304ofchromosome5AThesewereveryimportantformappedbasedcloneandmolecularassistantselection．Keywords：wheat，salttolerance，QTL2 1盐渍土壤概况第一章文献综述盐渍土指土体中含有过高盐碱成分的，包括盐土和碱士及其发生了一定程度盐化或碱化作用的各类土壤的总称。地球上除南极洲为冰川覆盖外，在世界各种类型陆地上均分布有盐渍土。据统计，世界盐渍土面积约10、m。，约占世界土地总面积的10％。我国根据农业部组织的第二次土壤普查(1974年开始1994年结束)资料统计，我国盐渍土面积3．5X107hr．2，相当于耕地的1／3。根据王遵亲、祝寿泉等最近考察，我国盐渍土总面积9．913x107hm2，盐渍土总面积较第二次全国普查数据大大增加(孙振元等2004)。主要分布在山东、河北、东北、新疆、甘肃等沿海及干旱和半干旱地区。随着我国人口的急剧增加及工业的高速发展，可耕地急剧下降。而不合理耕作、灌溉等又造成大量良田次生盐渍化。从而导致我国耕地逐年急剧下降。严重威胁着我国粮食生产。因此，如何利用和开发我国上亿亩盐渍化土壤，提高作物产量，成为我国农业生产中十分迫切和严重的问题。1．1盐渍土的危害1．1．1盐渍土对农业生产的危害盐渍土本质是土体中含有过高的可溶性盐分或十壤胶体上钠离子饱和度过太，对植物和微生物产生毒害，同时使土壤结构遭到破坏，土壤性质变劣，加上土壤可溶性盐分过高必定对植物营养元素产生拮抗，因此盐渍土对农业直接危害是盐渍土不能为作物提供正常水肥气热条件，加之盐碱成分生物毒害，使作物不能正常生长，甚至死亡。因此盐渍土对农业直接危害表现为限制了农业对土地资源的利用，降低了农业生产能力。1_1．2盐渍土对可持续发展的影响农业的可持续发展取决于农业生产的最基本生产资料一土地能否实现可持续利_}；}j，我国是一个土地资源十分匮乏的国家，13亿人口仅有10日hm2耕地并且以3X105_4X105hm2／年速度减少。我国目前人均耕地不到世界人均的1／3。为了获得足够的粮食，人们不得不开发盐渍士，可盐溃土未经治理前是不能交给农业的，而盐渍土治理往往需要较高的成本，加之士壤盐溃化本身会造成土壤生产能力下降和士地资源萎缩。因此土壤盐渍化对可持续发展必然产生严重负面影响。1．2盐渍土的利用途径目前，国际上改良和利用大面积的盐渍化土壤有两条基本的途径：一是通过农业T程措施改良土壤，降低土壤盐份，改善土壤环境，缓解作物生长的胁迫条件；其二是走生物学路线，挖掘、培育耐盐作物品种或开发利用有价值的盐生植物资源以改息土壤。前者如淡水压盐、挖沟捧盐、引黄放淤、筑堤种植、暗沟排盐等，这些工程投资量人又不能解决根本问题，下程一停，土壤 马上返盐，且洗盐同时将土壤中许多必需元素淋洗．特别是对我们这样经济不发达的国家，走农业工程措施是行不通的，更不能大面积推广。需要花费大量的人力、物力、财力，成本太高．且难以保持持久。在耕地面积日益减少，盐碱地逐年增加．淡水资源严重不足的情况一1-，走生物学路线，培育耐盐作物品种是改良和利用盐碱地资源最经济、最有效的措施之一，这对盐碱地区尽快建立合理的地貌结构，提高作物产量都具有重要的意义，也是长远而有效地利用盐碱化土壤资源的一条根本途径(王宝山，1997)。盐渍化所在地区多是我国小麦主产区，因此，培育小麦耐盐品种成为提高盐渍化土壤粮食生产的主要手段之一。2小麦耐盐性鉴定形态与生长指标2．1种子发芽率许多研究表明，在Nacl胁迫处理下，普通小麦和硬粒小麦的种子发芽率均与品种的耐盐性呈正比，而且与株高、秸秆及籽粒产量所表现的耐盐性相一致。在盐胁迫下耐盐小麦的发芽率比盐敏感小麦的高(刘志生，1996)。发芽率是种子活力的综合体现，在盐胁迫条件下种子发芽率高表明其吸水膨胀和萌动生根的综合能力强。2．2幼苗存活率小麦苗期是对盐胁迫反应的敏感期，在一定强度的盐胁迫下，敏感品种的幼苗就会死亡。孙金月等的研究表明，在不同海水盐浓度溶液中，4个耐盐小麦品种生长良好，而两个盐敏感品种第6天就受到严重伤害，随后幼茧陆续死亡。袁海涛(1996)等用8个小麦品种在土壤含盐量为0．3％一0．4％的田间进行研究，表明幼苗存活率高、苗全、苗壮是耐盐小麦品种的基本表现。因此，在实验室和田间试验中，可分别以一定盐浓度溶液培养下的幼菌存活率和三叶期调查的基本苗，作为小麦耐盐性鉴定的指标。2．3根长、苗高及苗重前人的研究表明盐胁迫条件下小麦出苗率明显降低，出苗时间显著推迟，小麦苗期的鲜重、干重、株高及根长均明显下降。在一定盐浓度范围，耐盐小麦品种和盐敏感小麦品种相比。其苗期生长状况明显好于后者，幼苗鲜重、干重、苗高F降幅度小，而且随着盐浓度的增加这种趋势也越加明显(朱建峰等，1996)2．4分蘖数袁海涛等(1996)的田间试验结果表明．盐碱地的“死、凉、板、薄”等特征致使小麦生长缓慢，越冬早，很难形成较大的冬前分蘖，所以春季分蘖是盐胁迫下小麦成穗的主要基础；而盐渍地春季返盐最为严重，小麦春季分蘖期正处于土壤返盐高峰期，因此春季分蘖数可以作为耐盐性的重要指标。4 2．5籽粒产量盐胁迫F的籽粒产量是小麦耐盐性的综合反应，高产稳产也是培育和选择耐盐品种的最终目标。因此，以籽粒产量作为小麦耐盐性鉴定指标是最具权威性的。3小麦耐盐分子育种的意义以往常规小麦耐盐品种的选育是通过不同小麦品种间杂交，然后在盐渍条件下根据一些与耐盐相关的形态、生理生化等表型形状在分离后代群体中选择耐盐材料，再经过多年的杂交使性状稳定下来．但我们知道，品种的耐盐性是一个由多基因控制的数量形状，作物对盐渍的反应也是多种多样，不仅与作物的基因型有关且受发生时间、强度及持续时间的影响，因此，必须在大田或温室对这些性状进行大量重复鉴定，以减低环境误差。这些困难都使得常规逐年杂交选育育种方案举步维艰。根据常规育种表型鉴定选育的耐盐品种受环境影响特别大，多年的杂交选育过程周期长，需要育种者具备丰富的育种经验。近年来．DNA分子标记技术发展迅猛，并且日益成为基因的遗传操作和植物育种的重要工具。随着分子生物技术及分子信息学的不断完善，尤其向数量性状遗传研究的扩展，为改良小麦耐盐性提供了新机遇。Zanksley等(1992)指出，通过RFLP或其他的分子标记进行标记辅助选择为难以测量的复杂性状提供了一条重要的选择途径，即可以把复杂的数量性状化解为简单的质量性状来研究，像研究质量性状一样，将它们分别定位在染色体上，并进而分析各个基因的单独效应及互作效应。借助分子标记及比较基因组学，可以建立高密度的小麦连锁图谱，再根据耐盐表型鉴定，在小麦基因组中直接找到对耐盐有贡献的相关QTL。为今后耐盐品种选育，QTL克隆奠定基础，最终分离出耐盐相关基因。4QTL定位方法的研究进展数量性状特点是受多基因控制，表现连续变异，杂交分离世代的表现型难以明确分组，个体在数量和程度上的差异只有通过度量才能具体化，度量值要用统计方法处理，其表现易受环境条件的影响。以前，人们一直以为数量性状受多个微效基因控制，各个基因效应是均等的．现在发现，控制数量性状的各个基因对性状的影响并不一样，而是有主效基因即贡献率大的QTL起关键作用，他们对性状的影响远远超过其他基因。大多数农艺性状均表现为数量性状的遗传特点，如产量、成熟期、品质、抗旱性等，耐盐性也不例外，属典型的数量性状，数量性状易受外界环境条件的影响，因此选择效果不好。以前由于缺乏足够的分子标记，影响了数量性状研究的进展，以致长期以来有关数量性状基因数目、基因位点、作用效果都不清楚。更无从谈起指导育种实践，最近凡年，SSR、AFLP等以PCR为基础的分子标记已大大方便了数量性状位点作图，一些数量性状基因已被绘制在连锁图上．并找到了与其紧密连锁的分子标记。有些已经开始用于育种实践。 4．1群体的选择构建遗传连锁图首先要有合适的群体，QTL作图定位有三种分离群体，临时性的分离群体、永久性分离群体和近等基因系群体，临时性的群体有亲本单交产生的F2群体、回交群体。F2群体是亲本杂交后得到F1代，在由其自交得到的群体。该群体每个株系都是唯一的，只能使用一代，不能设置重复，F2植株后代发生分离，很难进行多年多点研究。回交群体是F1代与一亲本回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较为简单，但提供的信息少，且材料有限，不能多代使用。永久作图群体主要是重组自交系群体(RIL)和加倍单倍体群体(DH)，RIL是由F2个体自交6代以上，获得的后代基因型相对纯合的群体。RIL可长期繁衍保存，作图精确性高，但耍建立RIL需要花费较长的时间。DH群体是Fl代诱导产生单倍体植株，在经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体，DH群体也能长时间繁衍保存，但DH群体受基因型的限制。QTL一近等基因系(QTL-NIL)群体，在QTL初步定位后就需要建立QTL近等基因系群体，进行QTL的精确定位。近等基因系是整条染色体组的绝大多数区域完全相同，只有少数几个甚至一个区段彼此间存在差异。因此，消除了其它背景的差异，增jll3QTL定位的精确性4．2遗传连锁图的构建建立高密度的遗传连锁图是QTL初步定位的基础，遗传连锁图构建成后，即可利用遗传连锁图上的分子标记定位QTL，通过计算分子标记和QTL之间的交换率，分析分子标记与目标性状QTL之问的连锁关系，从而确定QTL的具体位置。分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记与其他遗传标记相比．具有以下优点：直接以DNA形式出现，DNA标记在数量上是无限的。不受环境和其他因素的影响；多态性几乎遍及整个基因组；不影响目标性状的表达等；从图谱上可直接看出不同标记在整个生物基因组中的排列顺序，标记间的相对遗传距离。用于构建遗传连锁图的分子标记主要有RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)、AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、SSR(simplesequencerepeat)、EST-SSR(intersimplesequencerepeat)、SNP等。4．2．1．RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)标记限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)技术首先是由人类遗传学家Bostein(1980)提出。现在已广泛的用于许多植物遗传连锁图的构建(Tanksleyeta1．，1992；Dubcovskyetal1996)。该技术的特点是用放射性的同位素，与转移到支持膜上的基因组DNA(经限制性内切酶消化)杂交，通过显示限制性内切片段的大小，来检测不同遗传位点的等位变异，是共显性的分子标记，可以区分纯合基因型和杂合基因型，能够提供单个位点上的较完整的资料．而且稳定性好、重复性好。缺点对DNA的需求量大，作图花费的时间长。4．2．2．AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)标记6 扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP是由欧洲Zabeau等(1994)发明的。这种方法结合了RFLP和PCR的优点，是用PCR扩增DNA限制性酶切的片段，基因组的DNA先用两种限制性内切酶切割，一种是罕见的内切酶，一种是常用的内切酶。特点是限制性内切酶的种类很多，产生的标记数目多，多态性高．扩增片段短，分辨率高。假阳性率低，引物可在不同生物间通用。4．2．3．SSR(simplesequencerepeat)标记简单序列重复(simplesequencerepeat，SSR)，又称为微卫星标记。是指一类由1．6个核苷酸组成的基序或基本重复单位串联构成的一段DNA。他们广泛的分布在生物整个基因组的不同位置上，不仅可以存在内含子中，也可以存在编码区以及染色体的其它任何区域(Tautzetal，1984；)。SSR标记的特点是多态性高，在基因组中随机分布，覆盖整个基因组，共显性遗传。该方法需DNA少，操作简单，结果重复性好(Marioneta1．1998)。SSR标记是已知分子标记中多态性最好的，在小麦遗传研究中有广阔的应用前景。4．2．4．EST-SSREST(Expressedsequencetag)首先由美国科学家在人类基因组计划开始时提出，是长约300～500bp的基因表达序列片断。最初该技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5’端或3’端进行一部测序，得到的序列称为EST，从测得的EST序列中寻找SSR标记。许多国家和组织开展了EST计划(骆蒙和贾继增．2000)，向国际公共数据库中的EST数据库提交了大量EST序列，现在各种作物的EST序列正呈指数增长，快速增长的EST数据为SSR标记的开发提供了一个巨大的有价值的来源。从EST中发掘出的SSR，节省了大量人力、物力和财力；其次．其EST本身是功基因的一部分序列，所以它将为功能基因提供“绝对”的标记(朱振东和贾继增，2003，Gaoetal2004)。4．2．s．SNP标记单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指DNA序列中单个核苷酸的差别，包括单碱基的转换、插入、缺失等变化。不同基因组之间、同一基因组不同染色体之间及编码区与非编码区之间的SNP分布频率都不同。在人类基因组中，平均每1900个碱基对出现1个SNP(TheInternationalSNPMapWorkingGroup，2001)：在其它哺乳类动物中SNP的频率为每500～1000个碱基出现1次(OBden，1999)；玉米1号染色体中每104个碱基就出现1个SNP，其多态性程度比人类及果蝇要高得害；(Tenaillon．etal2001)。SNP可分为编码区SNP与非编码I_叉SNP；编码蛋白质的SNP有同义SNP及非同义SNP之分。编码区的ShIP有的可导致基因编码区氨基酸的变化，进而改变蛋白质序列及其功能。如举世 闻名的“绿色革命”基因就是株高基因，矮手于基因与高j}干基因的差异仅在于编码区的一个碱基的变化(Pengeta1．，1999)；大多数非编码区的SNP对蛋白质无直接的影响，表现同义或沉默，但是有一些非编码区的SNP影响基因的功能，如野生番茄与栽培番茄的果实大小差异主要也是由一个等位基因加22引起的，二者的差异在于启动子区8个碱基中的一个或几个碱基的变化(FrayA2000)。目前己开发出了许多自动操作的SNP的检测技术。分析结果可出计算机处理，其中DNA测序与自动化软件结合是至今SNP检测最可靠的方法，也是SNP作图最为直接方法。通过分析SNP。可以了解单个基因在复杂多基因控制性状中的贡献(Marshall，1998)．大量SNP的发掘也是基于连锁不平衡定位复杂性状和相关分析、定位、克隆复杂数量性状基因的重要前提(Davidetal2001)。4．3OTL定位的方法QTL作圈是确定某一个Q，rL与一个已知的基因组DNA标记相关的可能性，根据标记的基因型和待测得性状表现型，分析一个合适作图群体的全体。对于每一个DNA标记，根据标记基因型将样本中的个体分成组，计算和比较各组的平均值和方差等参数。组间差异显著表明DNA标记与控制性状的染色体位点有关，即DNA标记可能与一个QTL连锁。随着分子标记的发展，许多作杨有了高密度的分子标记连锁图谱。同时，生物信息学和生物统计学的快速发展使得数量性状的研究进入崭新的QTL时代。到目前为Jr，基于分子标记QTL的定位方法，主要有单标记分析法、区间作图法(LandeandBostein，1989)、复合区间作图法(Zeng，1993：Zhu，1998)以及基于混合线性模型的复合区间作图法(Wang，1998；高用明，2000)。所有QTL作图的方法原理是相确的，即当标记与特定性状的QTL连锁，不同标记基因型个体的表型值存在显著差异。4．3．1单标记作图法单标记分析法(Indibidualmarkermapping，IMM)是通过方差分析、回归分析或似然比检验，比较不同基因型数量性状均值差异。如果存在显著差异，说明标记与控制该数量性状的QTL连锁。单标记分析法不需要完整的分子标记连锁图谱，在早期QTL作图研究中多采用此法。单标记法存在以下缺点：不能确定标记是与1个QTL还是与几个QTL连锁；无法确切估计QTL的可能位置；由于遗传效应与重组率混合在一起，低估了QTL的遗传效应；容易出现假阳性：检测效率较低。4．3．2区间作图法鉴于传统的单标记作图法存在的问题，Lander和Botstein(1989)提出了基于两个相邻标记的区间作图法。Lander和Botstein以正态混台分布的最大似然函数和简单回归模型，借助_丁．完整的分子标记连锁图谱，计算基因组的任一相邻一对遗传标记之间的任一位置上存在和不存在QTL的似然函数比值的对数(LOD值)，根据整条染色体上各点的LOD值可以绘出一个Q'rL在该染色体存在与否的似然图谱·当LOD值超过给定的临界值时，QTL可能的位置就可以用8 LOD支持的区间表示出来。该方法曾被认为是构建QTL图谱的标准方法。区间作图法的缺点：定位的QTL区间往往太宽，而一个性状在同一染色体上有多个QTL时常常会标错QTL的位置，致使QTL定位不准确甚至出错误。4．3．3复合区间作图法为了克服区间作图法的上述缺陷以及能利用多个遗传标记的信息，Zeng等(1994)发展了复合区间作图法，并将多元回归分析引入区间作图，实现了同时利用多个遗传标记信息对基因组的多个区间进行多个QTL的同步检验。该方法的要点是，用类似于区间作图方法获得各参数的最大似然比，绘制似然图谱，获得QTL的可能位置和标记区间。此法侧重于QTL作图的精度，是目前可以同时标定多个QTL更有效、更精确的方法。复台区间作图的主要优点是：采用QTL似然图来显示QTL的可能位置和显著程度，保留了区间作图法的优点；一次只检验一个区间，把对多个QTL的多维搜索降低为一维搜索；在不存在上位性和环境互作时，QTL的位置和效应的估计是渐近无偏的；充分利用了整个基因组的信息；在较大程度上控制了背景遗传效应，提高了作图效率。复合区间作图法目前主要的问题有：不能分析上位性及QTL与环境互作等复杂的遗传学问题。4．2．4基于混合模型的复合区间作图法由于复合区间作图法不能检测上位性和QTL环境的互作，朱军等(1998)提出了基丁混合模型的复合区闷作图法。该方法把群体均值、QTL各项遣传效应(包括加往效应、显性效应和上位性效应)作为固定效应，而把环境效应、QTL与环境互作效应、分子标记效应及其与环境互作效应、残差作为随机效应，将效应估计和定位结合起来，进行多环境下的联合QTL定位分析，提高了作图效率和精度。Wang等(1999)开发了可以分析加性、加性×加性效应及其与环境互作效应的分析软件(QTLMapmakerI．O)。与基于多元回归的复合区间作圈方法相比，该方法可以避免所选标记对QTL效应分析的影响，可以无偏的估计QTL与环境的互作效应。4．4植物耐盐OTL定位研究进展像许多其它农艺性状一样，在基因水平上，植物的耐盐性是受多基因控制的数量性状(FooladandJones1993)。植物耐盐性QTLI㈣(FooladM．R．，JonesR，A．，1993；2001)，大麦(YoshiroM．andKazuyoshiT，1997)，大豆(LeeGJ．，etal2004)已有报道。在水稻上，许多实验室采用不同的指标也进行了耐盐QTL的定位作图(ChangS．L，，etal，1991and1995；GongJ，M．，1998；GuX．Y-，2000；LinH．，1998；ZhangGY，dal，1995)。番茄耐盐QTL的研究很幸运，在苗期鉴定了5+fdt蝴QTLs，其中三个QTL在两次不同的实验中均检测到(FooladMR1993；1999；2001)。番茄芽期和苗期耐盐QTL的研究表明：芽期耐盐相关QTL不同于苗期耐盐相关QTL，西红柿芽期耐盐性和苗期耐盐性分别由不同的耐盐QTL控制(Foolad，1999)。番茄苗期和芽期耐盐性在遗传和生理上有本能的差异。西红柿苗期在9 不同实验中均检测到的QTL对于分子标记辅助育种，耐盐QTL的定位克隆很有意义。芽期和苗期耐盐性的差异在拟南芥也有报道，拟南芥在芽期检测到了6个QTL，在苗期检测到了5个QTL,苗期也不同与芽期(Quesadaetal．，2002)。水稻耐盐QTL的研究较多，但是结果不一致。水稻耐盐QTL主要定位在1，4，5，6，7，8，9染色体上，2和3染色体还未见报道(ChengS．L．，etal，1991and1995；GongJ．M．，1998；GuX．Y，2000；LinH．，1998；ZhangGY，etal，1995，LinH．X2004)。在水稻上尽管许多人进行了耐盐QTL定位，但是结果不一。陈受宜等(1991)将水稻耐盐突变体基因定位在第7染色体上；Zhang等(1995)利用基因作图，在水稻1号染色体RGl46B附近还定位了一个盐诱导的称为sT的cDNA片段；龚继明等(1998)利用一个加倍单倍体(DH)群体及相应的遗传图谱，在I号染色体的RG612和C131标记之间定位了一个主效QTL．Std，另外其它7个微效QTL分布于不同的染色体上。尽管龚继明和Zhang均在l号染色体上进行了定位，但是并不是一个位点，龚继明还对成熟期水稻耐盐性鉴定，2个与成熟期耐盐相关的QTL定位在l号染色体分子标记RG612附近。Prasad等(2000)在6号染色体上定位了控制苗期耐盐性的QTL，Lin(2001)在水稻l，6。7号染色体分别定位了1个控制水稻苗期耐盐指数的QTL，对地上部和根部K，Na离子浓度、离子含量等生理性状定位的结果表明，7号染色体控制地上部Na离子浓度的QTL解释了48．5％的表型变化，在1号染色体定位了控制地上部K浓度的QTL，解释了40．1％的表型变化，此外在9号染色体定位了控制根部Na浓度的QTL．但是地上、地下K，Na离子的运输有不同基因控制，盐胁迫地上和地下没有重合的QTL11i)=点。Bonilla(2002)在水稻1号染色体定位控制盐吸收性状的称为‘Saltol’的QTL，该QTL解释了70％的表型变化，目前用近等基因系已经定位在了lcM，该QTL已经崩于分子标记辅助选择(LafitteH．R．，etal2004)。尽管在水稻上定位了一些效应比较大的QTL，取得了很大的进展，但这些QTL分布在不同的染色体上．这进一步说明了植物耐盐性的复杂性。YoshiroandKazuyoshi(1997)对人麦芽期耐盐性，结果表明控制芽期耐盐性的QTL主要定位于4(4H)、6(6H)、7(5H)、5(IH)，最有效的QTL位点定位于7(5H)，苗期的研究结果认为苗期耐盐相关的QTL主要定位在2(2H)，5(1H)，6(6H)和7(5H)，芽期和苗期的耐盐性有不同的QTL位点控制，和番茄一样说明大麦芽期的耐盐性不同于苗期。苗期耐盐相关的生理性状定位在大麦所有的7条染色体上，但是最火效应的QTL和大麦矮杆基因共定位在3H和ari—eGP共定位在5H染色体上，而且耐盐相关的生理性状QTL总是和控制成熟期的性状的QTL相关(Ellietal1997)。水分利用效率QTL(Handleyeta1．，1994)，干旱适应相关QTL(Chalmersetal1992)和抗盐相关QTL也定位在大麦4H染色体长臀上，育性相关的后选基因和Rubiscoactivase也图谱在4H染色体长臂上(BeckerandHetm，1995)。大麦成熟期的耐盐性QTL主要定位在3H、5H染色体上，而且效应最大的在5H染色体上(EllisP．R．，2002)。由此可见，大麦3H，4H，5H染色体在大麦耐盐性中起着主要的作用。4。5小麦耐盐分子标记研究进展O 小麦的耐盐性研究起步较早，但是耐盐基因定位工作开展较晚，WynJones和Shan分别在1984和1987对盐胁迫下二倍体、四倍体、六倍体小麦生物量、地上、地下K+、Na+离子含量及K+／Na+比进行了测定，结果表明小麦D基因组有控制小麦地上部K+／Na+I：E性状的基因。GothamJ(1987)通过染色体代换系(4D／4B，4D／4A)，证明小麦地上部控$i]K+／Na+比的基因定位在4D染色体的长臂上，而且拟贝尔脱山羊草属的ss染色体也有控制K+，Na_比性状的基因。GorlmmJ于1990年进一步证明携有4D长臂的小麦，地下部向地上部运输更多的l(+，更少的Na+，抗盐性也更强，而地下部离子含量影响不大。Schachtman(1992)也证明D基因组对六倍体小麦的抗盐性有重要的作用。Dorak(1994)通过QTL精细定位进一步表ItfJ4DL染色体的Knal基因位点控制小麦地上部的K+／Na+比和地上Na+含量。但是到目前为止，没有Knal基因被克隆的相关报道(MunnsRana2002)。Munns(2002)实验室用三个不同的F2代群体进行耐盐QTL的定位，结果仅在一个群体的2AL染色体上定位了一个控制Na+吸收性状的QTL，精细定位工作正在进行中，而其它群体未检测到。缺失体小麦的盐胁迫实验表明，第5同源群携带有对小麦耐盐性改良有关的基因(Forsteretal1988；1997)Koebner(1997)也用小麦的缺失体进行盐胁迫实验，结果表明缺失5D染色体植株存活力高于整倍体植株，5D染色体可能携有耐盐性基因。刘旭等用BSA方法筛选到与WMS67和WMS213标记紧密连锁的耐盐基因，并且证明该耐盐基因是由主效基因控制，定位在5BL染色体上。翁跃进(2002)用茶淀红和农大85102杂交，对F2代采用BSA方法，以盐胁迫下小麦的株高为耐盐生理指标找到一个控制小麦耐盐性的主效基I圈opz09．591，并认为茶淀红的耐盐性由一个主效基因控制。Quarrie(2005)对成熟期小麦耐盐性鉴定结果表明，小麦第5同源群5B和5D染色体带有控制小麦成熟期耐盐性的基因。由此可见，小麦耐盐QTLJE要定位在4DL、5D、5BL、2AL等不同的染色体上。采用QTL方法定位小麦耐盐相关基因，在苗期主要是采用K／NaLP,指标，在成株期采用产量相关指标。在苗期和芽期采用耐盐指数和耐盐生理指标还未见报道。5研究目的、内容5．1研究目的本研究目的是通过对温麦6号×山红麦重组自交系群体进行芽期和苗期耐盐性鉴定，耐盐QTL定位，找出控制小麦耐盐性的主效基因，为小麦耐盐基因的克隆，耐盐小麦品种的培育奠定理论基础．5．2研究内容本研究首先进行小麦耐盐指标的筛选，通过筛选的耐盐指标对小麦重组自交系群体进行芽期、苗期耐盐性鉴定，用Mapmaker／QTL软件进行耐盐QTL作图和定位。 6技术路线：重组自交系群体亲本耐盐性鉴定芽期苗期群体耐盐性鉴定芽期苗期耐盐相关性状分析耐盐性Q垃定图怍的●●●●●●●+LT 第二章温麦6号×山红麦重组自交系群体耐盐相关QTL的分析世界大约有20％的农业用地面积，50％可耕地受到盐碱的侵蚀(FlowersandYeo，1995)。盐碱地已成为制约粮食生产的主要因素之-(shuji，2002)。小麦作为世界上主要的粮食作物，其产量的高低直接影响到人们的生产和生活。提高小麦的耐盐性，保持小麦的高产、稳产是小麦的重要育种目标之一。植物的耐盐性是复杂的生理性状，像其它许多农艺性状一样是受多基因控制的数量性状(FooladandJones，1993Winicov1998)。植物耐盐性QZL在西红柿(Foolad，1993；2001)，大麦barley(YoshiroandKazuyoshi，1997)．大豆(Lee，etal2004)已有报道。在水稻上，许多实验室采用不同的指标也进行了耐盐QTL的定位作图(Cheng，etal，1991andt995；Gong，1998；Gu，2000；Lin，1998；2004；Zhang，etal，1995；YanoandSasaki1997)。小麦耐盐性研究较早，但耐盐基因的定位较晚。WynJones和Shah、Gorham、Dvorak等人通过不同倍性的小麦将控制普通小麦叶片KfNa比率的基因定位在4D染色体上(WynJone1984；Shan,1987；GorhalIl，1987；1990；Schachtmanetal1992)，Dvorak(1994)通过染色体代换系将控制叶片K／Na比的Kna／定位于4DL染色体上，其后，Dubcovsk(1996)将西w，基因进行TQTL定位，Knal基因和4DL染色体上的Xwgl99，Xabe305，Xpsr567，Xpsr375分子标记紧密连锁。Munns(2002)实验室用3个F2群体，对控制Na+吸收的性状的QTL进行定位，结果仅在一个F2群体的2AL染色体上定位了一个控$1]Na+吸收性状的QTL。芽期和苗期是研究小麦耐盐性的重要时期(Yoshiro，1997)。此前尚未见有关这两个时期小麦耐盐QTL研究的报道。本文报道的是用重组自交系永久作图群体对与耐盐性有关的耐盐指数、盐害指数、生物量指标等多个性状的QTL研究结果。1材料与方法1．1实验材料以农家种山红麦为父本，河南省小麦主栽品种温麦6号为母本杂交，获得F1代，通过一粒传加代获得F8代重组自交系，温麦6号×山红麦重组自交系群体，由儿6个株系组成。1．2方法I．2．1芽期耐盐性签定重组自交系群体的温麦6号×山红麦亲本及各株系播在9厘米的塑料培养皿中．每皿25粒种子。设0和300mmol／LNaC]两个处理，两次重复。0处理每皿加9ml去离子水，300mmol／LNaCl处理加9m1300mmol／LNaCI。盐处理7天调查耐盐指数。以芽长超过种子长度的1／2，根长超过种子长度的1倍作为发芽。 芽期耐盐指数=处理发芽率／对照发芽率。盐处理15天后，盐胁迫处理的种子切下的胚芽、胚根称鲜重，60"C恒温箱中过夜，称其干重。300mmol／LNaCl的配制：在1／1000天平上称NaCl8．7669。放在500ral容量瓶中，加去离子水搅拌定容至500m1．1．2．2苗期耐盐性鉴定l。2。2．1材料的培养苗期耐盐性鉴定在温室进行。亲本及群体的种子室温浸种催芽4天。选生长一致的各株系发芽种子移到泡膜板孔，把泡膜板漂浮在含有Hoagland半营养液水箱内，株距为4cm，行距为4cm，每隔8个株系加一次亲本材料和对照材料，水培苗每天光照14小时，光照度为300—800umotm2s1，通气时间为14小时。白天室温为20℃一30℃，夜间为15℃一20℃。水培至一叶一心进行盐处理，设0，300mmol／LNaCl两个处理．采用逐渐增加盐浓度的方法进行盐胁迫处理，每个处理2次重复，每个重复6株苗。Hoagland配制：去离子水配lL溶液I(N030．529／LC8(NO。)z0．829／LMgSO‘·7H200．499／LKH2P040．1369／LFe—EDTA1M(Fe—EDTA为7．459Na2EI)TA，5．579FeS04×7H20定容至1L)A—Z1M：也B虢2．89／LCuS04·5HzO0．089／LMnClz·6H201．189／L删oO·4Hz00．099／L1．2．2．2苗期耐盐性鉴定盐胁迫25天，进行苗期单株盐害指数的鉴定，盐害指数的分级按刘旭(2001)的如下方法进行：0级植株生长正常，没有盐害症状；1级植株的生长轻微受到盐抑制，仅叶尖焦枯2级植株30％的叶片枯黄或失绿；3级植株50％的叶片枯黄或失绿；4级植株大部分枯黄仅心叶绿：5级植株完全枯死。4 取株系平均值用于结果分析。苗收获后分成根和叶，先用自来水冲一遍，而后用去离子水冲洗3遍．吸水纸擦干t测量株高和根长，称鲜重，105"C杀青10分钟，70"C烘至恒重，称干重。1．3数据分析及QTL定位在苗期，地上干重、地上鲜重，地下干重、地下鲜重，单株干重、单株鲜重、株高、根长生物量指数是处理生物量与对照生物量的比值。所有数据用ExcEL软件进行处理，计算各个耐盐相关指标和耐盐指数的相关显著性。在已构建的温麦6号×山红麦重组自交系群体遗传连锁图(A、B、D基因组分别为66、66、58个分子标，共190个分子标记)基础上．采用QTLMapmakerl．0软件进行QTL作图，以概率值小于0．005，LOD大于2．0，作为判断QTL存在的标准。2结果和分析2．1盐胁迫浓度的确定21．1芽期盐胁迫浓度的确定小麦是中等耐盐作物，不同盐浓度对亲本的影响结果见图1，随盐胁迫浓度增加，亲本发芽率明显下降，但是温麦6号发芽率迅速下降，而山红麦下降不明显，山红麦较温麦6号耐盐。在200mmol／LNaCl胁迫F重组自交系群体亲本山红麦和温麦6号耐盐没有差异；在250mmol／LNaCl胁迫下二者有明显的差异，山红麦耐盐性高于温麦6号：在300mmol／LNaCl胁迫下，山红麦发芽率和温麦6号发芽率差异进一步增大：而在350mmol／LNaCl胁迫下，亲本山红麦和温麦6号发芽率差异缩小，但是山红麦发芽率仍然高于温麦6号；在400和450mmol／LNaCl胁迫下．两亲本几乎不发芽。这说明如胁迫浓度过高则耐盐性著的品种发芽受到明显抑制，耐盐材料和盐敏感材料的耐盐差异表现不出来，如胁迫浓度过低，都发芽，发芽率也没有差异，不能准确鉴定耐盐强的品种，在本实验中300mmol／LNaCl胁迫下重组自交系群体亲本发芽率有明显的差异，因此，本实验采用300mmol几NaCl进行芽期耐盐鉴定，在该浓度胁迫下后代耐盐性差异会更明显。l·2l*o8扮o．6蜒0402o200250300350400450盐处理浓度(mol／1)围I不同盐处理浓度下亲本山红麦与温麦6号发芽率 2．1．2苗期盐胁迫浓度的确定苗期予实验的结果表明，200mmol／LNaCl胁迫下，胁迫处理30天，亲本间盐害指数没有差异，后代个体间盐害指数也没有差异，400mmol／LNaCl胁迫一叶一心的幼苗，在日光温室不能很好的恢复生长，大多数幼苗枯死。而在300mmol／LNaCI胁迫下，即能克,q,＆400mmol／LNaCI胁迫不能生长的缺陷，同时处理Z饫，亲本盐害指数有差异，后代个体盐害指数呈明显的多态分布。所以苗期耐盐鉴定选300mmol／LNaCI进行耐盐性鉴定。2．2．耐盐性分析2．2．1．芽期耐盐性分析芽期耐盐性鉴定结果表明，在芽期山红麦的耐盐性高于温麦6号，两者有极显著的差异(图1)。胚根，胚芽鲜重为山红麦大于温麦6号，大多数后代的耐盐性和胚根、胚芽重量介于两个亲本之间，有少数超亲遗传，后代呈连续的正态分布，适于QTL作图(表1)。围1山红麦和温麦6号芽期耐盐性的差异(^．中国春；B：茶淀红；c：山红麦；D：温壹6号)固2温壹6号x山红壹重组自交系群体苗期耐盐性鉴定(^．对照；Bt盐处理)16 表1亲本山红麦和温麦6号与重组自交系群体耐盐相关性状的表型值2．2．2．苗期耐盐性分析在苗期，生物量指数(根除外)、株高指标温麦6号人于山红麦，盐害指数为温麦6号小于山红麦，表明在苗期亲本温麦6号的耐盐能力高于山红麦(表1)，而在芽期山红麦耐盐能力高于温麦G号，这说明芽期耐盐性不同于苗期耐盐性。茁期各耐盐相关指数在后代呈连续的正态分布，典型的数量遗传。2．3．耐盐相关性状和耐盐指数的相关分析以株系性状平均值进行耐盐相关性状间的相关分析，芽期相关性分析数据如表2。芽期耐盐指数(STGSS)和胚根鲜重(RFWG)、胚芽鲜重(PFV／G)之间极显著正相关，胚根鲜重，胚芽鲜重2个指标之间也呈极显著相关，表明胚根，胚芽鲜重可以作为耐盐筛选指标。表2芽期耐盐相关指标间的相关性分析·表明差异显著；#表明差异撮显著苗期盐害指数和单株干重指数，地上干重指数，地下干重指数．地上鲜重，单株鲜重指数呈极显著负相关，与地下鲜重指数，株高，根长相关性不显著。生物量指标间相关性极显著。株高与地上干重指标显著相关。与其它指标极显著相关，根长与其它生物量指标呈极显著相关。苗期 耐盐相关性分析表明植物耐盐性越高生物量越大，同时表明生物量指标(处理和对照生物量的百分比)可以作为耐盐指标。表3苗期耐盐相关指标间的相关性分析盐害指数地上干重地下干重单株干重地上鲜重地下鲜重单株鲜重株高指标根长指标●最明差异显著：#表明差异极显著芽期耐盐相关指标与苗期盐害指标、生物量指标间无相关性(数据术列)，这又表明芽期耐盐性和苗期耐盐性的差异，芽期耐盐，苗期不一定耐盐。芽期耐盐性不同于苗期耐盐性，这可能和二者的耐盐机制不同有关，芽期耐盐是种子吸水膨胀的能力，而苗期耐盐多是植株的拒Na+机制(王宝山等1997；杨红兵等2001)或通过渗透调节作用(朱志华1994)。2．4耐盐相关指标的QTL作图2．4．1．芽期耐盐相关指标的作图表4芽期耐盐相关OTL的定位芽期耐盐指数(STGSS)检测到6个QTL位点，定位在2B，3B，4A，5B，6B，7D6条染色体上(表 4)．解释44．27％的表型变异。其中位于7D染色体上的qSTGSS一7D一6位点贡献率最大．为11．75％。除7D染色体上的qSTGSS一7D一6位点对耐盐性的增加作用由父本山红麦提供外，其余位点的对耐盐性的增加作用均由母本温麦6号提供。胚芽鲜重(PFWG)检测到1个QTL位点，定位在4A染色体C468和M74P5011两个标记间，贡献率为18．76％，LOD值为3．6，母本温麦6号在该位点能增加胚芽鲜重。胚根鲜重(RFWG)检测到2个QTL位点，分布在4A和4B染色体上，总贡献率为3157％，其中qRFWG一4A一1位于4A染色体上C468和M74P50’I，贡献率最大为23．31％，加性效应为一0．2763，由母本温麦6号提供。qRFWG一2B一2位于4B染色体上，解释了8．26％的表型变化，加性效应为0．1645，父本山红麦在该位点能提高耐盐性。2．4．2．苗期耐盐相关指标的作图2．4．2．1苗期耐盐指数苗期耐盐指数共检测到3个QTL位点，分布在2B，3B，5A染色体上，总贡献率为17．89％。其中，分布在3B染色体上M38P37a-MC85的qSII一3B一1与控制芽期耐盐指数qSTGSS一3B2位点分布在同一个染色体区段，标记M38P37a和MC85问。qSTGSS一2B-1位点对耐盐性的增加作用由母本温麦6号提供，qSTGSS一3B～2和qSTGSS一5A一3两个位点对耐盐性的增加作用由父本山红麦提供。2．4．2．2单株鲜重单株鲜重指标共检测到3个OTL，分布在4B，7B，7D三条染色体上，贡献率由4．52到8．92％总贡献率为20．24％，对单株鲜重指标的增加作用均由父本山红麦提供。2．4．2．3单株干重单株干重指标共检测到2个QTLs分布在6B、7B两条染色体上，总贡献率为11．06％。父本山红麦能增加两个位点的单株干重。2．4．2．4地上鲜重指标地上鲜重指标检测到一个OTL位点，分布在4A染色体M51p36a-M51p36b标记间，贡献率为4．72％。2．4．2．5地上干重指标地上千重指标共检测到1个QTL，位于7B染色体M22P66b和M61p35d标记间，贡献率为7．83％，父本山红麦能增加该位点的地上千重指标。19 中国农业大学硕士学位论文表5苗期耐盐相关QTL定位性状QTLs染色体标记区间LOD加性效应值贡献率ChromIntervalSitel(M)Site2(M)LODAattriqSII一2B—l2BMS382一M41P42。11．8470．0752．51—0．2178526苗期盐害指数qSII一3B一23BM38P37a～MC85035200052．330．2073474qSll一5A一35AM41p55一MS3040．1335702677．89单株鲜重qPFWS一4B～4BM38P35b-MC38501460．0952I4536．8单株鲜重qPFWS7B一27BM22P66b—M61p35d0．9280133．191．6637892单株鲜重qPFWS一7D37DM61p35e—MC5171．41501952．371．1854452单株于重qPDWS一6B一16BMSl32-M61p40b02．380．01754．38单株干重qPDWS一7B一27BM61p35e-MC5171．6050．3853．9500209668地l鲜重qSDWS一4A一14AM51p36a—MSlp36b1．1580．32．81．09994．72地上于重qSDWS7B一17BM22P66bMflp35d0．8980．12．522．5535783地下鲜重qRFWS—IA-11AcSSR435一xpsp29990．0590．01522．36254．12地下鲜重qRFWS一1A2lAM61p37a一$991．4840．15523928029581地下鲜重qRFWS一3D一33DMC40I—MS710．5650．065208268935．35地下干重qRDWS一1A一1lAgflp37a一$991．4890162400357．82地下干重qRDWS一5A一25AM41p55-MS30400150．0152．50．03076．13地下干重qRDWS一7D一37DMS635一M75P35’l1．5140．12．380．0304574株高qSHS一1B一11BMS268一MSl241．64102．060．01682．39株高qSHS3B一23BM61p40d—xpsp303525810．32．0700202331株高qSHS一5A一35AM41p55一MS3040．045，480．03439．57株高qSHS一7A一47A$350一M35P43c05990．16210．02224．叭株高qSHS一7B一87BMS297一$6440．29106．0800346lO14株高qSHS一7D-67Dxpsp3123MS440．2390．043．14—0，025856根长qRLS1A一1IAMSl35一M36P33c1．2310．322．51003984．72根长qffLS一2A一22AM36P36b—M36P36c0．6740．022230．03313．22根长qRLS一2B32BMC382一M22P480．395024381004485．98根长qRLS一4A一44AM51p36a—M51p36b1．0980．242．03003653．83根长qRLS一5^一55Aff41p55一W83040．02235003864．49—立生—坐竺6_二L一：竺竺：：：!：：!：!：竺坐：!：!翌鲨2．4．26地下鲜重指标地下鲜重指标其检测到3个QTLs分布在1A、3D两条染色体上，总贡献率为15．28％．其中qRFWS_1A-1和qRFWS-IA一2位于1A染色体的不同区段，加性效应由父本山红麦提供。qRFWS一3D-3位于3D染色体上，加性效应也由父本山红麦提供。2．4．2．7地下干重指标 地F干重指标共检测到3个QTL位点，分布在1A、5A、7D三条染色体上，总贡献率率为19。69％，加性效应均由父本山红麦提供。2．4．2．8株高指标株高指标共检测到、6个QTL位于lB、3B、5A、7A、7B、7D六条染色体上，贡献率由2．39到10．14％，总贡献率为35．023％。qSHS-5A·3和qSHS-7B一5两个位点对株高指标的增加效应由父本提供，而qSHS-1B—l、qSHS-3B一2、qSHS-7A-4和qSHS．7D．6四个位点对耐盐性的增效作用由母本温麦6号提供。2．4．2．9根长指标根长指标共检测到六个QTL位点，分布在lA、2A、2B、4A、5A、7A六条染色体上，总贡献率为25．86％。母本温麦6号对qRLS-2A-2和qRLS一7A．6两个位点能增加根长指标，父本山红麦在qRLS-1A-1、qRLS·2B一3、qRLS一4A-4和qRLS一5A-5四个位点能增加根长指标。3讨论3．1耐盐相关指标的选择耐盐指标的选择一直是进行耐盐鉴定的一个重要问题．在不同时期，选择不同的耐盐指标可能会得出不同的结果。Yoshiro(1997)认为植物芽期和苗期的耐盐性很重要．植物初期的生长影响晟终的产量，因此小麦芽期、菡期鉴定更能有效的反缺小麦的综合耐盐性，对提高小麦盐渍地的经济产量更有效。本实验首先对小麦的两个重要时期芽期和苗期进行了耐盐性的鉴定。不仅采用芽期耐盐指数和苗期盐害指数，同时，在芽期又用了胚芽、胚根生物量，苗期采用各个生物量的比值．株高、报长等作为耐盐指标，对耐盐性较为综合的指标进行了鉴定。本实验采用胚根、胚芽的重量作为芽期耐盐指标，这使得耐盐指标数字化、具体化，结果更准确a相关分析的结果表明胚芽、胚根鲜重与芽期耐盐指数极显著正相关，表明耐盐性越高的材料胚根、胚芽生物量越大。耐盐指数、胚根、胚芽生物量共定位在4A染色体的同一区段也说明耐盐指数、胚根、胚芽鲜重可以作为小麦芽期耐盐性筛选的指标。盐胁迫条件下，植物材料盐处理和对照的生物量比值是评价植物耐盐性的重要指标(MunnsRetal2002)，生物量是植物对盐胁迫的适应性反映的综合体现及对盐胁迫的综合适应(Levitt，1980)。植物的耐盐性高，生长受盐胁迫的影响小，处理和对照生物量比值越大。在本实验，在盐胁迫条件下，耐盐的亲本生物量大，生物量指数也大；而盐敏感的亲本生物量小，生物量指数也小，重组自交系群体相关性分析表明，地上干重指数、鲜重指数，单株干重指数、鲜重指数和苗期盐害指数显著负相关．这也表明耐盐性高的材料，生长受胁迫的影响小。小麦地上、单株生物量指数可以作为耐盐生理指标。盐胁迫条件下·植物的生长受到抑制。翁跃进(2002)以盐胁迫下株高为耐盐生理指标找到21 了一个控制小麦耐盐性的主教基因。Diazdeleon等报道可以以盐胁迫处理与对照株高和根长的比值作为指标快速鉴定耐盐小麦，并指定了标准，认为与对照比株高和根长降低0-35％者为耐盐品种，降低36．68％为中耐盐品种，降低69．100％为盐敏感品种。本研究也以株高、根长在处理与对照条件下的比值进行了相关性分析和QTL定位，相关分析表明株高指标和根酶指标与盐害指数，均没有明显的相关性。从相关分析看株高指标和根长指标不能作为耐盐生理指标。综上所述，耐盐指数、胚根、胚芽生物量可以作为芽期耐盐相关生理指标。单株干重指数、单株鲜重指数、地上干重指数、地上鲜重指数可以作为小麦的苗期耐盐生理指标。扶高、根长不宜作为耐盐筛选的指标。3．2耐盐相关QTL在A、B、D不同染色体组上的分布重组自交系群体温麦6号×山红麦芽期耐盐性鉴定结果表明，在A基因组定位了3个QTL，在B基因组上定位了5个耐盐相关QTL，在D基因组定位了1个QTL，，在不同基因组定位的QTL数为B基因>A基因组>D基因组；苗期耐盐相关QTL定位结果表明：在B基因组定位了lo个耐盐相关QTL，在A基因组定位了13个耐盐相关QTL，D基因组定位了3个耐盐相关QTL，苗期耐盐相关QTL定位数为A基因组>B基因组>D基因组。综合芽期和苗期耐盐鉴定结果表明：温麦6号×山红麦重组自交系群体耐盐相关QTL为A基因组>B基因组>D基因组。这和重组ih变系群体OPATA85×W7984的鉴定结果一致(马丽清，2006)。温麦6号×山红麦重组自交系群体分子标记连锁图的结果显示，A基因组有66个标记，B基因组有66个标记，D基因组有58个标记，D基因组分子标记数目最少，所以D基因组耐盐相关QTL数目最少，一方面可能是与D基因组分子标记数目少有关，另一方面可能是D基因组耐盐相关基因少。3．3共定位或成簇分布的QTL在本实验，共检测到35个耐盐相关QTL，其中芽期9个，苗期26个，分布在15条染色体上．许多QTL在染色体上成簇分布，甚至分布在同一染色体区段或同一位点。在4A染色体C468．M74P50～1标记间，定位了控制芽期耐盐指数的qSTGSS-．4A一3，控制胚芽鲜重的qPFWG．4A．1，控制胚根鲜重的qRFWG．4A．1位点，LOD值分别为3．29，3．6，5．98，加性效应为一0．623、一O．1242、-O．2763，均由父本提供。这些都是和芽期耐盐相关的性状，而在该位点投有检测到苗期耐盐相关的QTL，这表明在4A染色体C468．M74P50～1间有控制芽期耐盐性的主效QTL位点。在5A染色体M41p55-MS304间检测到了控制苗期盐害指数、地下干重、株高、根长的QTL位点(qSll一5A-l，qRDWS一5A-2，qSHS一5A-3，qRLS·5A一5)。LOD值由2．35到5．48，加性效应均来自母本温麦6号，在该位点没有检测到芽期耐盐相关QTL，表明该位点是控制苗期耐盐性的QTL位点。本实验结果表明，山红麦重组自交系群体苗期的耐盐性不同于芽期，在芽期山红麦耐盐性强于温麦6号，而在苗期温麦6号耐盐性强于山红麦：QTL定位的结果表明，4A染色体 C468-M74P50～1间有控制芽期耐盐性的主效QTL位点，而5A染色体M41p55-MS304间是控制苗期耐盐性的QTL位点；耐盐相关指标的定位结果也表明。芽期耐盐相关指标和苗期耐盐相关指标间无任何相关性，这表明芽期耐盐性不同于苗期耐盐性，这和大麦的结果是一致的(YoshiroandKazuyoshi，1997)。Paterson(1995)和Veldbloom(1994)认为性状相关的QTL经常定位到同一个位点。本实验许多性状相关的QTL也定位在了同一染色体区段。在本研究中控制相关性状也经常定位在染色体的同一区段，在1A染色体M61p37a-S99定位了控制地下鲜重、地下于重、根长的QTL，这些性状都是和根有关，在7A染色体s350-M35p43c间定位了控制株型(株高和根长)的QTL；在7B染色体M22P66b-MC517间定位了控制生物量(单株鲜重、单株干重、地上千重)的QTL。3．4与前人研究结果比较本研究采用温麦6号×山红麦重组自交系群体共定位了35耐盐相关QTL．其中芽期9个，苗期26个，分布在除2D、3A、4D、5D、6A、6D外的15条染色体上。WynJones和Shah、Gorham、Dvorak等人通过不同倍性的小麦将控制普通小麦叶片K／Na比率的基因定位在4D染色体上(WynJone1984；Shan，1987；Oorhan,1987；1990；Sehachtmanetalt992)，Dvorak(1994)通过染色体代换系将控制叶片KfNa比的Knal定位于4DL染色体上，其后，Dubcovsk(1996)将Knal基因进行了QTL定位，Knal基因和4DL染色体上的Xwgl99，Xabc305。Xpsr567，Xpsr375分子标记紧密连锁。重组自交系群体Opata85XW7984耐盐相关QTL定位结果表明，4DL染色体xck0108l-xfbb226问是控制小麦芽期耐盐性的QTL位点(马丽清，2006)．本实验在4DL染色体上没有检测到耐盐相关QTL，原因之～可能是不同的材科带有不同的耐盐基因，定位在不同的染色体上，也可能是在4DL染色体上确实有耐盐相关QTL但是由于本重组自交系群体的连锁图上标记太少，没有定位上去。Mutms(2002)实验室用3个F2群体，对控制Na+吸收的性状的QTL进行定位，结果仅在一个F2群体的2AL染色体上定位了一个控制Na+吸收性状的QTL．本研究在2A染色体上没有检测到耐盐相关QTL。Quarrie(2005)对成熟期小麦耐盐性鉴定结果表明，小麦第5同源群5B和5D染色体带有控制小麦成熟期耐盐性的基因。刘旭等(2001)用BSA方法筛选到与WMS67和WMS213标记紧密连锁的耐盐基因，并证明该基因是一主效基因，定位在5B染色体上。缺失体小麦的盐胁迫实验表明，第5同源群携带有对小麦耐盐性改良有关的基因，Koebner(1997)也用小麦缺失体进行盐胁迫实验．结果表明缺失5D染色体植株的存活力高于整倍体小麦，5D染色体可能携有耐盐性基因。本实验在第5同源群的5A染色体，5B染色体定位了耐盐相关QTL，而且5A染色体M41p55．MS304间检测到了控制茁期盐害指数、地下干重、株高、根长的QTL位点(qsn．5A一1，qRDWS．5A．2。qSHS．5A．3．qRLS．5A．5)多个耐盐相关基因成簇分布，可能是主效位点，5B染色体M42P37a-S499定位了控制芽期耐盐指数的QTL，但是在5D染色体上没有发现耐盐相关基因。此外本实验还定位了一些新的小麦耐盐相关QTL，在4A染色体WMC468一M70P36b间定位了控制芽期耐盐指数、胚根鲜重、胚芽鲜重的QTL，而且贡献率由3．83到23％，是一控制芽期耐盐性的主效QTL位点。在lA、lB、2B、 3B、4B、5B、6B、7A、7B、7D等染色体上都定位了耐盐相关QTL，这是前人未报道的，也说明植物耐盐性是受多基因控制的复杂的生理性状(Mikikoeta1．，2001)。本实验耐盐QTL的定位结果说明植物对盐胁迫反映的复杂性，同时也说明基因表达的时空性，在苗期表达的基因不一定在芽期表达，反之亦然。本实验有许多染色体区域是共定位或紧密连锁的QTL，这些不同性状共同指向的区域可用于耐盐标记的辅助选择，提高抗盐育种的进程，同时为图位克隆耐盐基因提供理论依据。24 第三章结论1．用不同浓度的盐处理重组自交系群体温麦6号×山红麦，结果表明在300mmol／LNaCI胁迫处理条件下，两个亲本耐盐性有明显的差异，在该浓度下适宜进行重组自交系群体的耐盐性鉴定。2．芽期耐盐性状相关分析表明，胚芽鲜重、胚根鲜重与芽期耐盐指数显著正相关，可以作为芽期耐盐指标。3．苗期耐盐性状相关分析表明，单株鲜重指标、单株干重指标、地上千重指标、地上鲜重指标、地下干重指标与苗期盐害指标显著负相关，可以作为小麦苗期耐盐性筛选的指标。4，重组自交系群体温麦6号×山红麦群体，芽期耐盐相关性状与苗期耐盐相关性状没有相关性。5．应用QTLMapmakerl．0软件对重组自交系群体温麦6号×山红麦进行耐盐相关QTL定位，共定位了35个耐盐相关性状，其中芽期9个，苗期26个，分布在15条染色体上。其中4A染色体C468-M74P50’I标记间，定位了控制芽期耐盐性(qSTGSS-4A-3)、胚芽鲜重(qPFWG一4A-1)及胚根鲜重的(qRFWG-4A一1)位点，是控制芽期耐盐性的主效OTL位点：5A染色体M41p55-MS304间检测到了控制苗期盐害指数、地下干重、株高、根长的OTL位点，是控制苗期耐盐性的主效QTL位点。 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姓名：周二峰职称：高级讲师健康状况：良好党派：中国民主促进会会员外语：英语、日语教育及工作背景：1988、9一1992、71992、7—1994、71994、7一至今1999、5一1999、12003、3一至今工作成绩：个人简历性别：男专业：园艺学历：在职研究生兼职；廊坊市政协委员河北科技师范学院大城第一职业中学廊坊职业技术学院13本长野松本市中国农大农学学士教师研修农业推广硕士◆1997--1999年参与河北省“科教兴村”计划在廊坊永清里澜城的实施，该基点被评为全国优秀基点◆1998年受到廊坊市农林系统嘉奖◆1999年被民进河北省委授予“为科技成果转化为生产力”先进会员◆2001年民进河北省委省级优秀会员◆承担廊坊市课题“苹果优种密植早果早丰配套技术研究”1998年获市级一等奖◆2001--2003年承担河北省级课题“北方草坪景观效果保持技术研究”◆“尽快完善农产品监测体系，规范农产品市场”2005年被评为廊坊市政协优秀提案◆2005年民迸河北省省级优秀会员◆2006年廊坊市青年科技奖提名奖论文发表情况：在省级以上报刊杂志发表农业科普教育论文24篇