肥大细胞在细菌性腹泻中的作用机制研究论文

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1、郑州人学2009届博_l：研究生毕业论文肥人细胞往细菌性腹泻中的作用机制研究肥大细胞在细菌性腹泻中的作用机制研究博士研究生：冯百岁导师：李建生郑州大学第一附属医院消化内科河南郑州450052摘要腹泻的发病机制早己得到广泛讨论，但其确切机制仍需要深入研究。事实上，肠上皮细胞对大量细菌及其成分已产生耐受性，但是微生物产物是如何打破这种已建立的耐受并诱发腹泻和其它炎症发生的仍然不很清楚。肥大细胞位于宿主和外环境的表面如皮肤、呼吸道和肠道。肥大细胞被认为是宿主抵御细菌感染的关键物质。但是，微生物产物诱导肥大细胞介质释放从而导致腹泻的机理尚不清楚。金黄色葡萄球菌(Stap

2、hylococcusaureus。＆aureus)是感染性腹泻的病因之一。肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)是几乎所有G+和G‘菌的细胞壁成分，具有很强的免疫活性，它能够改变免疫细胞的功能。并可能在细菌性腹泻中起关键作用。本研究的目的：1)PGN对T84细胞单层(人类肠上皮细胞系)屏障功能的影响；2)肥大细胞对T84屏障功能的影响；3)肥大细胞系对PGN吸收途径；4)口服PGN诱发小鼠腹泻模型的建立；5)TLR2(Toll。likereceptor，TLR)和NODs(Nucleotide—bindingoligomerizationdomain，NO

3、D)在介导PGN诱发的肠道肥大细胞激活过程中的意义；6)肥大细胞激活在PGN诱导的腹泻中的必要性。实验方法1．细胞培养和T84细胞单层功能的检测本实验采用T84细胞单层(T84Monolayer)细胞。为了评估T84细胞单层转运PGN，我们把来自金黄色葡萄球菌的纯化的PGN及HRP(Horseradishperoxidase，HRP)加入到细胞跨膜培养系统中。采用ELISA的方法检测样本中的PGN、HRP。HRP流量作为评价T84细胞单层的通透性指标。郑州人学2009届博十研究生毕业论文‘肥大细胞n：细菌性腹泻中的作用机制研究2．人肥大细胞系HMC．1、人单核细

4、胞系THP．1、人中肾上皮细胞系HEK293吸收和转运PGN的检测T84细胞单层和HMC．1(THP．1、HEK293)共同培养于细胞跨膜培养系统中，然后加入PGN至肠腔侧中，2h后收集细胞。细胞蛋白提取后用Western．Blot的方法检测细胞中的PGN成分。一部分细胞用冷的丙酮固定后，用抗PGN单克隆抗体及荧光标记的兔抗鼠II抗孵育，共聚焦显微镜观察。3．组织胺分析用ELISA试剂盒检测MHC．1(THP．1、HEK293)、小鼠结肠粘膜肥大细胞及P815细胞(小鼠肥大细胞系)5-HT(5．羟色胺)和组织胺水平。4．已敲除HMC．1细胞中TLR2和NOD2的

5、表达RNAi技术用于检测已敲除HMC．1细胞中TLR2和NOD2的表达。siRNA转染的效果通过RT-PCR和Western．Blot的方法检测。5．PGN诱发的鼠类腹泻动物模型用纯化的PGN不同剂量溶于生理盐水中灌胃，灌胃自玎用肥大细胞对抗物预处理。计算每只小鼠粪便中含水的百分比。记录每只小鼠的小肠、大肠湿重及体重。小肠和大肠占体重的比率作为评估肠道液体的指标。6．P815细胞TLR2、NODl的表达免疫细胞化学、Western．Blot方法观察P815细胞TLR2、NODl的表达情况。7．免疫染色共聚焦显微镜观察造型小鼠肠粘膜肥大细胞及P815细胞TLR2、

6、NOD(1or2)的表达。8．肥大细胞重建培养的肥大细胞(纯度>95％)以30，000，40，000，和50，000个细胞／只的剂量通过尾静脉注射到肥大细胞缺如小N(W／Wv)体内1月后用于重复口服PGN实验。统计学处理采用SPSSl0．0软件对数据进行统计分析。所有数据均以Xa：SD表示，组间差异用t检验检测，三组及三组以上的组间比较用方差分析，P<0．05认为差异具n郑州大学2009届博上研究生毕业论文肥大细胞在细菌性腹泻中的作用机制研究有显著性。．结果1．把PGN加入细胞跨膜培养系统的肠腔侧，把T84单层的TER(Transepithelialelectr

7、icresistance，TER)和T84对HRP的通透性作为检测屏障功能的指标。结果表明，只加PGN并不降低T84细胞单层的TER和通透性，与对照组相比没有明显差异。说明PGN并不直接破坏肠粘膜屏障。2．把融合的T84细胞和HMC．1共同培养在细胞跨膜培养系统中。在加入PGN到肠腔侧2h后，培养基中组织胺的释放量的增加呈剂量依赖性，电镜结果表明肥大细胞广泛脱颗粒。T84细胞单层的TER在PGN刺激后明显降低，并且在肥大细胞稳定剂预处理后明显得到抑制。由此证实T84细胞转运的PGN是通过激活HMC．1而完成的。3．为了证明TLR2介导PGN在肥大细胞中的吸收，把

8、HMC．1培养在含有或不