钠钾atp酶α1亚单位在肝癌细胞生长调节中的作用

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1、目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文钠钾A，印酶al亚单位在肝癌细胞生长调节中的作用前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7刖舌”一““一““一”“““”一““一””一””一”一一一”一””一“一一””·7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果·····················-··············⋯····································28附I羽····

2、·······································································35讨论·····························································-·············7l结论·································⋯⋯····································78参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯79综述钠钾ATP酶抑制剂强心甾类固

3、醇抗肿瘤作用的研究进展······························⋯····································85致谢·················································-·························94个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯95中文摘要钠钾ATP酶伍1亚单位在肝癌细胞生长调节中的作用摘要目的：本研究以肝癌HepG2细胞为靶细胞，探讨天然钠钾ATP酶抑制剂华蟾酥毒基和钠钾ATP酶al亚单

4、位基因沉默对肝癌HepG2细胞生长和细胞周期的影响，观察钠钾ATP酶下游相关信号途径分子基因的表达变化，探讨钠钾ATP酶Ql亚单位在肝癌细胞生长调节中的作用。方法：(1)靶向钠钾√m酶a1亚单位s枞质粒表达载体的构建与筛选：设计、合成靶向人钠钾-m酶(N“K+．ATPase)a1(A，rPlAl)mRNA的3对DNA序列，分别插入Pgenesil．3中构建编码ATPlAl的短发夹RNA(sbRNA)质粒表达载体shRNA．ATPlAl(j岍1A11，ATPlAl2和A1P1A13)，经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认。筛选并确定最佳细

5、胞接种量及重组质粒转染量，半定量逆转录聚合酶链反应(RT．PCR)和免疫细胞荧光检测Na+／K+．-岍aseal表达变化，从而确定沉默效果最明显的shRNA．A，rPlAl。(2)Mn法和流式细胞术检测沉默效果最明显的√岍lAl3和华蟾酥毒基对HepG2增殖活性和细胞周期的影响。(3)形态学观察：倒置光显微镜观察细胞形态结构改变；荧光显微镜下观察DAPI染色后的细胞形态。(4)RT．PCR检测√m1A13和华蟾酥毒基作用于HepG2细胞不同时间，CDK2，PCNA，cyclinA，p21，p53，c．src，＆n，姬Kl，僦，ERK，c．

6、Myc删烈A的表达变化。(5)实时定量荧光PCR检测-册1A13和华蟾酥毒基作用于HepG2细胞24h后各基因IIl】眦～的表达变化。(6)Westenlblot检测ATPlAl3和华蟾酥毒基对CDK2，PCNA，CyclinA，p53，C．SrC，ERK，p-ERK和c．Myc蛋白表达的影响。结果：(1)质粒构建及筛选：构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带，经测序符合设计要求，构建成功。ATPlAl2和j岍lAl3对所转染的HepG2细胞中Na锨+．ATP舔e仅l删险队和蛋白表达均有抑制作用，其中ATPlAl3最为明显。实时定量

7、荧光PCR检测A，rPlAl3敲低HepG2Na切r．ATPaSe仅l伽ⅢA呈时间依赖性，72h后表达降低约90％。(2)生长抑制作用：ATPlAl3和华蟾酥毒基均可抑制HepG2细胞生长。中文摘要转染试剂和阴性质粒转染对HepG2细胞的生长抑制不明显。华蟾酥毒基对HepG2细胞的生长抑制作用呈时间浓度依赖性，高浓度的华蟾酥毒基(10岬ol／L)对细胞抑制显著，而低浓度(O．01岬ol／L)对细胞的增殖抑制作用明显降低。经直线回归计算，24h，48h，72hIC50分别为(3．039士O．371)、(O．758士o．102)和(O．133

8、士o．028)岬。儿o(3)细胞周期改变：ATPlAl3和华蟾酥毒基都可使H印G2细胞周期发生S期阻滞。转染48h和60h，S期细胞由正常的(27．60士1．98)％升至(39．4士2．04)